@phdthesis{Romfeld2010,
  author    = {Romfeld, Lars},
  title     = {Charakterisierung der Rolle des Proteins p8 in der proliferationsassoziierten Signaltransduktion in Insulin produzierenden beta-Zellen des endokrinen Pankreas},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-45318},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Ein m{\"o}glicher Ansatz neuer Therapiestrategien f{\"u}r Diabetes mellitus besteht zum einen in der Differenzierung von Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen und zum anderen in der Beschleunigung der Zellproliferation ebensolcher Zellen. In zahlreichen Studien wurden bereits mitogene Signaltransduktionswege in beta-Zellen des endokrinen Pankreas unter dem Einfluss diverser N{\"a}hrstoffe untersucht. Das Protein p8, urspr{\"u}nglich im Umfeld einer experimentell induzierten akuten Pankreatitis im Rattenmodell als Stressantwort beschrieben, ist an einem glukoseabh{\"a}ngigen Zellwachstum in der insulinproduzierenden beta-Zelle des endokrinen Pankreas beteiligt. Insofern ist es nur schl{\"u}ssig, die Rolle des Proteins p8 im Rahmen der proliferationsassoziierten Signaltransduktion zu untersuchen. Zur n{\"a}heren Charakterisierung von p8 wurden von unserer Arbeitsgruppe Wildtyp-INS-1-Zellen (WT-INS-1), als Modell f{\"u}r die beta-Zelle des endokrinen Pankreas, mit einem durch IPTG induzierbaren, p8-exprimierenden System ausgestattet (p8-INS-1). Dieses System wurde in der vorliegenden Arbeit zun{\"a}chst auf seine Funktionalit{\"a}t hin {\"u}berpr{\"u}ft. Unter anderem konnte p8-cDNA in den stabil transfizierten p8-INS-1-Zellen und in den mit obigem Plasmid transient transfizierten WT-INS-1-Zellen dargestellt werden, wobei letztere WT-INS-1-Zellen st{\"a}rker signalisierten und somit ein h{\"o}heres „output" an p8 zu generieren scheinen. In Immunoblotanalysen ergab sich ein {\"a}hnliches Bild. Durch p8-{\"U}berexpression kommt es zu einem zunehmenden Signal des Proteins p8 innerhalb der p8-INS-1-Zellen. Jedoch erscheint dieses Signal in WT-INS-1-Zellen noch st{\"a}rker. Ebenso ließen sich mehrfach Doppelbanden sowohl bei p8-INS-1-Zellen als auch bei WT-INS-1-Zellen bei 14 kDa und 22 kDa darstellen. Das differenzierte Expressionsmuster beider Zelllinien im Rahmen dieser Immunoblotanalysen legt den Schluss nahe, dass eine Erh{\"o}hung des p8-Levels, sei es nun durch Induktion per IPTG-Gabe oder durch Wachstumsfaktoren, zu einem ver{\"a}nderten Molekulargewicht des Proteins p8 f{\"u}hrt. Das Protein p8 unterliegt somit st{\"a}ndigen Ver{\"a}nderungen im Rahmen der Protein-Protein-Interaktion. Im Vordergrund stehen Phosphorylierungen als Aktivierungsinitiatoren und Ubiquitinierung mit synergistischer Proliferationszunahme unter p8-{\"U}berexpression und gleichzeitiger Proteasomhemmung. Gerade in Phasen erh{\"o}hten Zellstresses (Hypo- und Hypernutrition) lassen sich durch p8-{\"U}berexpression erh{\"o}hte Wachstumsraten nachweisen, w{\"a}hrend im physiologischen Bereich nur bei gleichzeitiger Proteasomhemmung Wachstumssteigerungen durch p8-{\"U}berexpression erreicht werden k{\"o}nnen. Dies unterstreicht einmal mehr die Rolle von p8 als Stressprotein. Nichtsdestotrotz {\"u}bertreffen die Proliferationsraten der p8-INS-1-Zellen die der WT-INS-1-Zellen unter den verschiedensten Stimulationsbedingungen bei weitem. So konnte gezeigt werden, dass in den p8-INS-1-Zellen eine progrediente, glukoseabh{\"a}ngige Proliferation vorliegt, welche sich durch Gabe von IGF-1 oder foetalem K{\"a}lberserum (FBS) zu einem signifikanten synergistischen Wachstum ausweiten l{\"a}sst. Und auch hier erzeugt p8 als Stressprotein bei p8-INS-1-Zellen im glukosefreiem Medium bei alleiniger Stimulation mit Wachstumsfaktoren signifikante Wachstumsraten im Vergleich zu WT-INS-1-Zellen. Die Umsetzung der Stimulation durch Glukose und Wachstumsfaktoren auf die p8-vermittelte Proliferation vollzieht sich innerhalb der Signaltransduktion. Mit Phosphatidylinositol-3´-Kinase (PI3´K) als Schl{\"u}sselprotein innerhalb der mitogenen Signaltransduktion und Proteinkinase C (PKC alpha, beta, gamma) konnten durch Co-Immuno-pr{\"a}zipitationen, GST-Pull-Downs, Immunoblotanalysen aber auch Inhibitionsversuche wichtige Interaktionspartner von p8 identifiziert werden. Weitere Bindungspartner des Proteins p8 resultierten durch Inhibitionsversuche mit Proteinkinasen wie PKCzeta und PKA, aber auch p38 MAPK als Vertreter des MAPK-Signalweges. Dabei zeigt sich ein relativ gleiches Bild mit tendenziell eher m{\"a}ßigen Proliferationshemmung im niedrigen bis normalen Glukosebereich, welche sich unter p8-{\"U}berexpression verst{\"a}rkt. Verschiedene Regelkreise zur Feinsteuerung der p8-vermittelten Proliferation scheinen hier denkbar. Sollte p8 neben der Zellproliferation auch zu einer Aktivierung der genannten Proteine f{\"u}hren, k{\"o}nnte die Inhibition dieser Proteine ihrerseits die p8-vermittelte Proliferation hemmen. Auf Proteinebene ließ sich die Verbindung zwischen p8 und MAPK p38, PKCzeta, PKA und PKB nicht nachweisen, erscheint aber wegen der Prim{\"a}rstrukturen der Proteine, sowie Erkenntnissen aus der bisherigen Literatur und auch aufgrund der Versuche mit Proteininhibitoren im Rahmen dieser Arbeit wahrscheinlich. Weitergehende Untersuchungen sollten daher noch erfolgen. Die vorgestellten Ergebnisse sind ein Beitrag zum besseren Verst{\"a}ndnis der Rolle des Proteins p8 innerhalb der mitogenen Signaltransduktion als eine Voraussetzung f{\"u}r einen kurativen Ansatz des Diabetes mellitus Typ I.},
  subject      = {B-Zelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Attinger2010,
  author    = {Attinger, Hannah Marie},
  title     = {Bedeutung der nukle{\"a}ren Lokalisationssequenz (NLS) des Proteins p8 f{\"u}r die Kerntranslokation und seine Proliferation induzierende Wirkung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47534},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {p8 ist ein erstmals im Zusammenhang mit akuter Pankreatitis beschriebenes Protein, das im exokrinen und endokrinen Pankreas mit vermehrtem Zellwachstum assoziiert ist. Bei der Analyse seiner Prim{\"a}rstruktur wurde ein spezies{\"u}bergreifend hoch konservierter Abschnitt, eine sogenannte NLS, ausgemacht, der HMG-Y/I-Proteinen {\"a}hnelt. Da HMG-Proteine oft als Transkriptionsfaktoren wirken, wurde die Hypothese formuliert, auch p8 sei ein HMG-Y/I-Protein und wirke als Transkriptionsfaktor im Nukleus. Um die Bedeutung der rp8-NLS n{\"a}her zu charakterisieren, wurde in INS-1 beta-Zellen ein rp8(NLS-)-EGFP Fusionsprotein ektopisch exprimiert, um dessen subzellul{\"a}re Lokalisation zu untersuchen. Es zeigte sich, {\"a}hnlich wie bei Kontrollzellen mit ektoper Expression von EGFP allein, eine gleichm{\"a}ßige Verteilung von rp8(NLS-)-EGFP zwischen Zytoplasma und Nukleus. Da rp8(NLS-) trotz fehlender NLS dennoch in den Kern translozieren kann, scheint die NLS f{\"u}r diesen Vorgang nicht essentiell zu sein. Diese Annahme wird gest{\"u}tzt durch die Beobachtung, dass einzeln exprimiertes rp8(NLS-) seine Proliferation induzierende Wirkung nicht verliert. In Zellz{\"a}hlungsexperimenten zeigte sich, dass ein rp8- bzw. p8(NLS-)-EGFP Fusionsprotein keinen proliferationsf{\"o}rdernden Einfluss in INS-1 und hMSC-TERT Zellen hat. Bei ektoper Expression von rp8 bzw. rp8(NLS-) und hrGFP als Einzelproteine konnte jedoch eine zwischen beiden rp8-Varianten {\"a}hnliche und insgesamt signifikante Stimulation der Zellvermehrung beobachtet werden. Dies belegt, dass die Fusion von rp8 an EGFP dessen biologische Funktion inhibiert, w{\"a}hrend die Deletion der NLS keinen Einfluß darauf hat. Da der proliferative Stimulus von p8 in menschlichen hMSC-TERT Zellen unabh{\"a}ngig von der Herkunft von p8 aus Ratte oder Mensch ist, scheint p8 bei S{\"a}ugern hoch konserviert zu sein und spezies{\"u}bergreifend zu wirken. Aus der hier vorgestellten Arbeit geht hervor, dass der molekulare Mechanismus, {\"u}ber den p8 glukoseabh{\"a}ngig proliferationsinduzierend in INS-1 beta-Zellen wirkt, nicht {\"u}ber die NLS vermittelt wird. Weitere Untersuchungen der Wirkungsweise von p8 auf molekularer Ebene k{\"o}nnten in Zukunft einen Ansatz zur in vitro-Generierung ausreichender Mengen an beta-Zellen zur Zelltherapie des Diabetes mellitus bilden.},
  subject      = {Diabetes mellitus},
  language  = {de}
}