@phdthesis{Kukat2008, author = {Kukat, Christian}, title = {Fusion, Fission und Nucleoids in Megamitochondrien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30467}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In rho0-Zellen, die {\"u}ber keine mitochondriale DNA (mtDNA) mehr verf{\"u}gen, entstehen w{\"a}hrend der Kultivierung Megamitochondrien durch endogene Milchs{\"a}ure-Azidifizierung des Kulturmediums. Diese Riesenorganellen bilden sich dabei durch mitochondriale Fusionsereignisse und/oder eine Hemmung der Fission. In Zellen mit mitochondrialem Genom ist es ebenso m{\"o}glich Megamitochondrien durch artifizielles Ans{\"a}uern des Kulturmediums zu induzieren. Diese Erkenntnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit als Werkzeug verwendet, um Einblicke in mitochondriale Fusions- und Fissionsereignisse zu erlangen. Zun{\"a}chst wurde die Fusion mitochondrialer Matrixkompartimente mithilfe der photoaktivierbaren Variante des gr{\"u}nen fluoreszierenden Proteins (PA-GFP) untersucht. Hiermit konnte gezeigt werden, dass das Vermischen der Matrixkompartimente nach der Fusion ein sehr schneller Prozess ist. Die Analyse der Bildung und R{\"u}ckbildung der Megamitochondrien erfolgte sowohl konfokal- als auch elektronenmikroskopisch, wobei sich zeigte, dass die Matrix der Riesenorganellen kaum mehr Cristae beinhaltet. Die R{\"u}ckbildung der Megamitochondrien zum normalen Netzwerk ist ein sehr schneller Prozess, bei dem schon nach 15 min keine vergr{\"o}ßerten Organellen mehr sichtbar sind. Dies indiziert, dass der R{\"u}ckbildungsprozess wahrscheinlich durch Ver{\"a}nderungen von verf{\"u}gbaren Proteinen durchgef{\"u}hrt wird, ohne die Induzierung von Proteinneusynthese. Untersuchungen auf ultrastruktureller Ebene zeigten, dass es w{\"a}hrend der R{\"u}ckbildung zur Formation von drei unterschiedlichen Mitochondrientypen kam, die sich in ihrer Morphologie stark unterschieden. Weiterhin wurden vergleichende Studien zur Bildung der Megamitochondrien durchgef{\"u}hrt, bei denen der Einfluss von Atmungsketten-Inhibitoren auf die Bildung von Milchs{\"a}ure-induzierten Riesenorganellen untersucht wurde. Die Resultate deuten f{\"u}r die Megamitochondrieninduktion auf eine Abh{\"a}ngigkeit auf ein intaktes Membranpotential hin. Immunzytochemisch wurde die endogene Lokalisation der mitochondrialen Fusions- und Fissionsproteine Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L am Modellsystem der Megamitochondrieninduktion aufgekl{\"a}rt. Es zeigte sich, dass diese Proteine punktf{\"o}rmig an der {\"a}ußeren Membran der Riesenorganellen lokalisieren Um das Modellsystem an lebenden Zellen zu nutzen, wurden Vektoren konstruiert, die fluoreszenzmarkierte Proteine der mitochondrialen Fusions- und Fissionsmaschinerie exprimierten. Hiermit konnte einerseits die Lokalisation von Mitofusin 1, Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L in lebenden Zellen nach Induktion der Megamitochondrien analysiert werden und andererseits der Einfluss der {\"U}berexpression dieser Proteine auf die Bildung der Riesenorganellen dokumentiert werden. Die Ergebnisse machten deutlich, dass nur die {\"U}berepxression von hFis1 die Bildung der Megamitochondrien verhinderte. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Visualisierung und Dynamik mitochondrialer Nucleoids in lebenden Zellen. Nucleoids sind Protein-DNA-Komplexe, in denen mitochondriale Genome organisiert sind. Mit dem Farbstoff PicoGreen gelang es mtDNA in lebenden Zellen zu f{\"a}rben und Dynamikstudien der punktf{\"o}rmigen Strukturen mikroskopisch festzuhalten. W{\"a}hrend sich mtDNA im mitochondrialen Netzwerk nur marginal aufgrund stattfindender Fusions- und Fissionsereignisse bewegte kam es in den Milchs{\"a}ure-induzierten Megamitochondrien zu einer extensiven und extrem schnellen Bewegung von mitochondrialer DNA. In anschließenden Versuchen wurde der mitochondriale Transkriptions- und Verpackungsfaktor TFAM als fluoreszentes Fusionsprotein in Zellen transfiziert und Kolokalisationsstudien zeigten, dass das Fusionsprotein mit mtDNA kolokalisiert. In den Riesenorganellen pr{\"a}sentierten punktf{\"o}rmige TFAM-gef{\"a}rbte Nucleoids ein sehr dynamisches Verhalten mit schneller Bewegung. In rho0-Zellen ohne mitochondriale DNA war die TFAM-Fluoreszenz hingegen gleichm{\"a}ßig verteilt. Ein weiterer Nucleiodbestandteil ist das mitochondriale DNA-Einzelstrangbindeprotein SSBP1, welches in Megamitochondrien ebenso ein sehr dynamisches Verhalten aufwies. Eine mitochondrial-zielgesteuerte und EGFP-markierte Restriktionsendonuklease wies ebenfalls das typische, punktf{\"o}rmige Nucleoidmuster im mitochondrialen Netzwerk auf, was auf eine Interaktion mit der mtDNA schließen l{\"a}sst. In rho0-Zellen ohne mtDNA kam es jedoch zur gleichm{\"a}ßigen Verteilung des Konstruktes in den Mitochondrien. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit sowohl Einblicke in die Biologie der Megamitochondrien gewonnen, als auch Erkenntnisse {\"u}ber die Dynamik mitochondrialer Protein-DNA-Komplexe, wobei der Schwerpunkt hierbei auf einer Analyse mit Hilfe optischer Methoden lag.}, subject = {Mitochondrium}, language = {de} } @phdthesis{Hein2008, author = {Hein, Manuela}, title = {Zytologie von Hirntumoren in der P{\"a}diatrie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35271}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Diskussion der h{\"a}ufigsten soliden Hirntumorentit{\"a}ten in der P{\"a}diatrie. Analyse der im Rahmen der HIT-2000-Studie angefertigten Liquorpr{\"a}parate sowie der im Rahmen dieser Studie gesammelten pers{\"o}nlichen Daten der betroffenen Kinder bez{\"u}glich der H{\"a}ufigkeitsverteilung der einzelnen Entit{\"a}ten, des Eintretens einer zytologischen / radiologischen Meningeose oder von soliden Metastasen, Vergeich der Sensitivit{\"a}t radiologischer und zytologischer Verfahren, Vergleich des jeweils m{\"o}glichen Resektionsausmaßes, H{\"a}ufigkeit des Auftretens von Rezidiven oder Todesf{\"a}llen, Aussagem{\"o}glichkeiten der Zytologie.}, subject = {Cytologie}, language = {de} } @phdthesis{Semlanski2011, author = {Semlanski, Christin Martina}, title = {Beeinflussung der Substratbindungsregion des organischen Kationentransporters 1 der Ratte durch Mutation einer intrazellul{\"a}r gelegenen Aminos{\"a}ure}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65672}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {1994 wurde von Gr{\"u}ndemann et al. der erste organische Kationentransporter, der rOCT1 beschrieben. Es wurden bereits einige Aminos{\"a}uren identifiziert, die bei der Bindung kationischer Substanzen beteiligt sind. Hierbei handelt es sich um Phenylalanin 160 der zweiten Transmembrandom{\"a}ne, Tryptophan 218, Tyrosin 222 und Threonin 226 der vierten Transmembrandom{\"a}ne, um Arginin 440, Leucin 447, Glutamin 448 der zehnten und um Aspartat 475 der elften Transmembrandom{\"a}ne. Hintergrund der Versuche dieser Arbeit war das im Jahre 2005 von Sturm et al. identifizierte Cystein 451. Es liegt zwischen der zehnten und elften Transmembrandom{\"a}ne. Cystein 451 ist wahrscheinlich auf Grund seiner Lage im Strukturmodell nicht direkt an der Bindung von Substraten beteiligt. Es wird vermutet, dass die Mutation des Cysteins 451 die Positionen von Aminos{\"a}uren in der Bindungsstelle ver{\"a}ndert. Daher wurden die Mutante C451M, die Doppelmutanten L447F/C451M, L447Y/C451M und die Dreifachmutante Y222F/L447F/C451M mittels Tracer-Fluxexperimenten hinsichtlich der Hemmung der Tetraethylammonium-Aufnahme durch Kortikosteron und durch Tetrabutylammonium untersucht. Die Mutation C451M steigert verglichen mit dem rOCT1-Wildtyp die Affinit{\"a}t f{\"u}r Kortikosteron, jedoch sinkt bei dieser Mutante die TBuA-Affinit{\"a}t. Man nimmt nun aufgrund dieser Mutageneseversuche und den bereits zuvor generierten Modellen des rOCT1 an, dass aufgrund seiner Lage Cystein 451 nicht direkt an der Bindung von Substraten beteiligt ist, sondern einen indirekten Effekt auf die Substratbindungsregion des Transporters aus{\"u}bt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Mutanten L447Y/C451M und L447F/C451M gegens{\"a}tzliche Affinit{\"a}ten f{\"u}r TBuA und Kotikosteron haben. Tauscht man das Leucin an Position 447 gegen ein Tyrosin aus, so wird der Transporter weniger affin f{\"u}r Kortikosteron, jedoch steigt die TBuA-Affinit{\"a}t. Tauscht man das Leucin gegen ein Phenylalanin aus, verh{\"a}lt es sich gegens{\"a}tzlich. Die Position 222 scheint weder an der TBuA-Bindung, noch an der Bindung von Kortikosteron maßgeblich beteiligt zu sein.}, subject = {Cytologie}, language = {de} }