@phdthesis{Stuhlfelder2004,
  author    = {Stuhlfelder, Christiane},
  title     = {Reinigung, Klonierung und heterologe Expression der Methyljasmonat-Esterase aus Lycopersicon esculentum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8433},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Aus Lycopersicon esculentum Zellsuspensionskulturen konnte ein bisher unbekanntes Enzym isoliert und beschrieben werden, das die Hydrolyse von Methyljasmonat (MeJA) zu Jasmons{\"a}ure (JA) katalysiert. Das Enzym wurde als Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) bezeichnet. Mittels Methyl-[2-14C]JA und [Methyl-3H]MeJA wurden qualitative und quantitative Enzymtestsysteme etabliert, welche die Reinigung und Charakterisierung des Enzyms erlaubten. Methyljasmonat-Esterase Aktivit{\"a}t konnte in 18 taxonomisch unterschiedlichen Zellsuspensionskulturen h{\"o}herer Pflanzen sowie in differenziertem Gewebe (Bl{\"u}te, Wurzel, Stengel und Blatt) von Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker nachgewiesen werden. In einem 6-stufigen Reinigungsverfahren wurde das native Enzym mit einer Ausbeute von 2.2 \% bis zur Homogenit{\"a}t 767-fach angereichert. Die native MeJA-Esterase kommt nativ als monomeres 26 kDa großes Protein vor. Unter denaturierenden Bedingungen konnte ein Molekulargewicht von 28 kDa bestimmt werden. Eine Analyse mittels ESI-TOF-Massenspektrometrie ergab ein Molekulargewicht von 28547 Da. Die native MeJA-Esterase hatte ein basisches pH-Optimum von 9.0. Optimale katalytische Aktivit{\"a}t zeigte die MeJA-Esterase bei einer Reaktionstemperatur von 40 \&\#61616;C. Der isoelektrische Punkt lag bei pH 4.7. Eine vollst{\"a}ndige und irreversible Hemmung der MeJA-Esterase konnte durch 5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), einem Serinprotease-Inhibitor erzielt werden. Dieses Ergebnis lieferte einen Hinweis darauf, dass die MeJA-Esterase eine katalytische Triade mit einem reaktiven Serin-Rest besitzt. N-Methylmaleimid, Iodacetamid, Bestatin, Pepstatin und Leupeptin konnten die MeJA-Esterase nicht inhibieren. Nach der Reinigung der MeJA-Esterase wurde das Protein partiell mit der Endoproteinase LysC verdaut. Mittels Sequenzierung der Spaltpeptide und N-terminaler Sequenzierung der MeJA-Esterase konnte von vier Peptiden die Sequenz bestimmt werden. Ein Datenbankvergleich (SwissProt und EMBL) dieser Peptide mit bekannten Sequenzen zeigte eine hohe Homologie (bis zu 80 \%) zu verschiedenen Esterasen und \&\#945;-Hydroxynitrillyasen. Die Peptide konnten somit eindeutig als Bestandteile einer Esterase identifiziert werden. Zur Identifizierung des MeJA-Esterase Gens wurden aus den Peptidsequenzen degenerierte Primer abgeleitet und zur weiteren Klonierung verwendet. {\"U}ber eine Reverse Transkription mit anschließender PCR wurde ein internes cDNA-Fragment (513 bp) amplifiziert. Mittels RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) konnten das 5´-und 3´-Ende der MeJA-Esterase cDNA ermittelt werden. Die Nucleotidsequenz umfasste einen offenen Leserahmen von 786 bp. Die davon abgeleitete Aminos{\"a}uresequenz codierte ein offenes Leseraster f{\"u}r ein Protein von 262 Aminos{\"a}uren. Datenbankvergleiche der vollst{\"a}ndigen Aminos{\"a}uresequenz zeigten Homologien von 33 - 47 \% zu Esterasen und \&\#945;-Hydroxynitrillyasen. Die Aminos{\"a}uren der katalytischen Triade, die in den homologen Proteinen hochkonserviert waren, konnten bei der MeJA-Esterase als Serin-83, Asparagins{\"a}ure-211 und Histidin-240 ermittelt werden. Diese drei Aminos{\"a}uren bilden vermutlich das katalytische Zentrum der MeJA-Esterase. Dar{\"u}ber hinaus konnte eine hochkonservierte Signatur, die allen Lipasen gemeinsam ist in der Aminos{\"a}uresequenz der MeJA-Esterase identifziert werden. Diese Ergebnisse erlauben eine Einordnung der MeJA-Esterase in die Superfamilie der „alpha/beta-Fold"-Hydrolasen. Untersuchungen der Prim{\"a}rstruktur der MeJA-Esterase legten den Schluss nahe, dass es sich um ein cytosolisches Enzym handelt. Eine Southern-Blot Analyse mit genomischer DNA aus L. esculentum wurde zur Absch{\"a}tzung der Kopienzahl der zum Protein der MeJA-Esterase korresporendierenden Gene durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden zwei bis sieben DNA-Abschnitte ermittelt, die mit der Volll{\"a}nge-Sonde der MeJA-Esterase hybridisierten. Dieses Ergebnis l{\"a}sst vermuten, dass die MeJA-Esterase zu einer Genfamilie geh{\"o}rt. Unklar bleibt jedoch, ob es sich um mehrere homologe Gene handelt, oder ob eine Hybridisierung der Volll{\"a}nge-Sonde mit Pseudogenen erfolgte. Die heterologe Expression der MeJA-Esterase cDNA wurde erfolgreich durchgef{\"u}hrt. Hierdurch wurde der Beweis erbracht werden, dass die klonierte cDNA tats{\"a}chlich f{\"u}r das Gen der MeJA-Esterase codierte. Nach Klonierung der cDNA in den pQE70-Expressionsvektor und Transformation in kompetente E. coli (M15) konnte im Proteinrohextrakt eine spezifische Enzymaktivit{\"a}t von 1.64 pkat/mg detektiert werden. In einem 4-stufigen Reinigungsverfahren wurde das heterolog exprimierte Enzym mit einer Ausbeute von 0.8 \% bis zur Homogenit{\"a}t 283-fach angereichert. Untersuchungen zur Substratspezifit{\"a}t zeigten, dass native und heterolog exprimierte MeJA-Esterase Methyljasmonat zu Jasmons{\"a}ure hydrolysierten. In beiden F{\"a}llen handelte es sich jedoch um kein hochspezifisches Enzym. F{\"u}r die native MeJA-Esterase konnte ein KM-Wert von 14.7 ± 0.8 µM und f{\"u}r die heterolog exprimierte MeJA-Esterase ein KM-Wert von 24.3 ± 2.3 µM ermittelt werden.},
  subject      = {Tomate},
  language  = {de}
}