@phdthesis{Gonnert2005,
  author    = {Gonnert, Falk Alexander},
  title     = {Entwicklung eines Modells zur mikrokalorimetrischen Analyse der Wirkung pharmakologischer Substanzen auf den Energiestoffwechsel benigner und maligner Zelllinien am Beispiel von 2,4-Dinitrophenol},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21495},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Krebs durch gezielte Zerst{\"o}rung seiner Energien zu besiegen, ist einer von mehreren vielversprechenden neuen experimentellen Therapieans{\"a}tzen, die insbesondere in den letzten Jahren in den Fokus des Interesses ger{\"u}ckt sind. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein Modell zu entwickeln, mit dem die Wirkung von 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP), ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung, auf den W{\"a}rmehaushalt einer Vielzahl an benignen und malignen Zelllinien mit der Methode der Mikrokalorimetrie analysiert werden kann. Nach zahlreichen Vorversuchen konnte schließlich ein ad{\"a}quates Messsystem definiert werden, das den Anforderungen eines großen Stichprobenumfangs gerecht wurde: die zu untersuchenden Zellen wurden auf 200 mm2 großen Glaspl{\"a}ttchen als Monolayer kultiviert und in sonderangefertigten Stahlampullen in einem Mediumvolumen von 3.6 ml unter Verwendung eines geschlossenen Mikrokalorimetriesystems hinsichtlich ihrer W{\"a}rmeproduktion f{\"u}r eine Dauer von 9 Stunden untersucht. St{\"o}rfaktoren wie insbesondere Mediumver{\"a}nderungen oder Substratlimitierungen konnten durch erg{\"a}nzende Untersuchungen ausgeschlossen werden. Die Vorversuche und erste Datenanalysen der Versuchsreihen mit der pA1-Zelllinie identifizierten einen unerwarteten St{\"o}rfaktor: die Pl{\"a}ttchendichten variierten trotz strikter Standardisierung bei der Kultivierung der Monolayer erheblich. Um diesen St{\"o}rfaktor in den Datenanalysen zu ber{\"u}cksichtigten, wurde daher eine verl{\"a}ssliche und exakte Methode zur Ermittlung der Pl{\"a}ttchendichten gesucht. 3 verschiedenen Methoden wurden hierf{\"u}r auf ihre Eignung {\"u}berpr{\"u}ft, bis schließlich der LDH-Test als ad{\"a}quates Verfahren zur Bestimmung der Pl{\"a}ttchendichten ausgew{\"a}hlt wurde. Anschließend erfolgte ein Testdurchlauf mit 4 Zelllinien und 4 unterschiedlichen Dosisstufen 2,4-DNP (zuz{\"u}glich der Nulldosis). Nach Durchf{\"u}hrung der ersten Versuchsreihen mit der pA1 Zelllinie konnte ein weiterer St{\"o}rfaktor identifiziert werden: der ‚crowding-Effekt'. Dieser beschreibt das Ph{\"a}nomen, dass mit zunehmender Zellzahl in einer Kultur die Stoffwechselrate und somit auch die W{\"a}rmeproduktion einer Zelle abnimmt. Der crowding-Effekt wurde im Rahmen mikrokalorimetrischer Arbeiten unter Verwendung offener Systeme und somit Zellsuspensionen mehrfach beschrieben und diskutiert. Die vorliegende Arbeit konnte einen crowding-Effekt nun auch f{\"u}r Monolayer nachweisen. F{\"u}r die vorliegenden Daten konnte der Zusammenhang zwischen W{\"a}rmeproduktion und Zellzahl mittels Regressionsanalyse mit der mathematischen Funktion lgY=-0.83lgX+6.31 bei einer Verl{\"a}sslichkeit der Sch{\"a}tzung von R2=0.9003 beschrieben werden. Als spezifische Ursachen f{\"u}r einen crowding-Effekt bei Monolayern wurden angenommen: - Diffusionsprobleme bedingt durch unger{\"u}hrtes Medium um die Pl{\"a}ttchen herum, - wider Erwarten dreidimensionales Wachstum auf den Pl{\"a}ttchen, oder, - Wachstumsinhibition durch Kontakthemmung der Zellen auf den Pl{\"a}ttchen. Der St{\"o}rfaktor crowding-Effekt ist auf Grund seines dynamischen Charakters schwierig zu eliminieren. Dennoch konnten M{\"o}glichkeiten aufgezeigt werden, das Ausmaß des crowding-Effekts deutlich zu reduzieren, so dass das Modell optimiert werden konnte. Der multivariate Charakter sowie der große Umfang der Daten stellte hohe Anforderungen an eine geeignete Methodik f{\"u}r eine Auswertung der Daten. Auf Erfahrungen anderer Arbeiten konnte nicht zur{\"u}ckgegriffen werden, da bis dato keine Arbeiten von solch großem Stichprobenumfang durchgef{\"u}hrt wurden. Einfache statistische Analysen stellten sich als nicht geeignet heraus. Mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Kennwert und dem Verfahren nach Wei und Lachin konnten jedoch schließlich zwei Instrumente f{\"u}r eine ad{\"a}quate Datenanalytik bestimmt werden, die eine Datenanalyse im Sinne der Fragestellung des Projektes umfassend erlauben. Eine erste Auswertung der Daten des Testdurchlaufs zeigte, dass vor allem niedrigere Dosisstufen im Konzentrationsbereich bis 50 µM 2,4-DNP interessant sind. Erg{\"a}nzende Datenanalysen wiesen darauf hin, dass 2,4-DNP offenbar die Stoffwechselaktivit{\"a}t von Zellen unmittelbar nach Zugabe um einen bestimmten Betrag erh{\"o}ht und diese dann auf diesem Niveau kontinuierlich f{\"u}r eine bestimmte Zeit anh{\"a}lt, bis schließlich ein Wirkmaximum erreicht wird, das von der H{\"o}he der Dosis abh{\"a}ngt. Als Ursachen f{\"u}r die je nach Dosisstufe unterschiedlich lange Wirkung von 2,4-DNP wurden verschiedene Ursachen diskutiert, die es weiter abzukl{\"a}ren gilt. Wahrscheinlich scheint jedoch eine Zytotoxizit{\"a}t h{\"o}herer Dosierungen. Durch die erg{\"a}nzende Analytik bestimmter Stoffwechselparameter gelang es, den crowding-Effekt auch f{\"u}r den spezifischen Glucose-Verbrauch nachzuweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass 2,4-DNP nicht nur durch Kurzschluss des Protonengradienten die W{\"a}rmeproduktion erh{\"o}ht, sondern auch den Substratverbrauch der Zelle steigert: bei einer Konzentration von 100 µM 2,4-DNP erh{\"o}hte sich der spezifische Glucoseverbrauch um etwa 50\%. Untersuchungen der Laktatproduktion ließen außerdem vermuten, dass die Stoffwechselsteigerung von 2,4-DNP eher oxidativ bedingt ist. Durch die vorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein geeignetes Messsystems f{\"u}r die mikrokalorimetrische Analyse einer Vielzahl an Zellen etabliert werden. Durch einen anschließenden Testdurchlauf mit 4 unterschiedlichen Zelllinien konnte zudem das System optimiert und eine ad{\"a}quate Methodik f{\"u}r eine aussagekr{\"a}ftige Datenanalyse bestimmt werden. Es steht somit ein Modell zur Verf{\"u}gung, mit dem die W{\"a}rmeproduktion einer Vielzahl an Zelllinien auf die Wirkung von 2,4-DNP, aber auch von anderen Substanzen, untersucht werden kann, was schließlich die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen erm{\"o}glicht.},
  language  = {de}
}