@phdthesis{Riekert2019, author = {Riekert, Maximilian}, title = {Der Einfluss mesenchymaler Stammzellen auf T-Zellsubpopulationen bei gesunden Probanden und Patienten mit rheumatischen Erkrankungen}, doi = {10.25972/OPUS-17819}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178195}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {In dieser Arbeit wurde der Einfluss mesenchymaler Stammzellen (MSC) auf verschiedene T-Zellsubpopulationen in vitro untersucht. Dazu wurden Naive- und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen aus humanen PBMCs von gesunden Probanden und Patienten mit Autoimmun-Arthritis bei rheumatischen Erkrankungen isoliert und im Beisein/in Abwesenheit von MSCs unter Th-17-polarisierenden Bedingungen kultiviert. Nach einer 6 Tage umfassenden Inkubationszeit erfolgte die flowzytometrische Bestimmung des Ph{\"a}notyps, der Proliferation, der Apoptose, des Zytokinprofils und der Chemokinrezeptorexpression Naiver und Nicht-Naiver-CD4+ T-Zellen im Beisein/in Abwesenheit von MSCs. Die Ph{\"a}notypen wurden als CD45RA+CD27+ Naive-, CD45RA-CD27+ Ged{\"a}chtnis-, CD45RA- CD27- Effektor- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen definiert und ihre jeweiligen prozentualen Anteile an allen CD4+ T-Zellen bestimmt. Nach Beurteilung der Proliferation und Apoptose, erfolgte die Analyse der IFNγ-, IL-17-, IL-9- und IL-13-Produktion f{\"u}r jeden der vier Ph{\"a}notypen. Zus{\"a}tzlich wurde der prozentuale Anteil an FoxP3+CD25+CD127- Tregs und deren IL-10-Produktion bestimmt. Abschließend erfolgte die Messung der CCR5-, CCR6- und CXCR3- Expression. Insgesamt konnte sowohl in der Naiven CD4+- als auch in der Nicht-Naiven CD4+ T- Zellfraktion eine Hemmung der Proliferation und Apoptose CD4+ T-Zellen durch MSCs gemessen werden. Zudem supprimierten MSCs die Produktion der Zytokine IFNγ, IL-17, IL-9 und IL-10 und steigerten teilweise die Produktion von antiinflammatorischem IL-13. In den vier untersuchten Ph{\"a}notypen verhielt sich die Zytokinproduktion variabel und war bei CD45RA-CD27+ Ged{\"a}chtnis- und CD45RA-CD27- Effektor-Zellen am gr{\"o}ßten. Der hemmende Einfluss der MSCs war auf diese beiden Ph{\"a}notypen ebenfalls am st{\"a}rksten ausgepr{\"a}gt. CD45RA+CD27+ Naive- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen produzierten in Kultur mit MSCs mitunter vermehrt proinflammatorische Zytokine. Analog zur Proliferation und Apoptose verminderten MSCs die Expression von CCR5, CCR6 und CXCR3 auf CD4+ T-Zellen. Die beschriebenen Effekte der MSCs konnten sowohl bei gesunden Probanden, als auch bei Patienten mit rheumatischen Erkrankungen nachgewiesen werden. Durch die Verwendung eines Transwell®-Systems konnte gezeigt werden, dass MSCs ihre Wirkung auf T-Lymphozyten nicht nur durch direkten Zell-Zell-Kontakt, sondern auch {\"u}ber l{\"o}sliche Faktoren aus{\"u}ben. Die Resultate dieser Arbeit verdeutlichen den immunsuppressiven Charakter der MSCs auf Naive und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen unter Th17-polarisierenden Bedingungen in vitro. Jedoch zeigt die Analyse der Zytokinproduktion in den untersuchten T-Zell-Ph{\"a}notypen, dass MSCs neben ihrer immunsuppressiven Eigenschaft die Zytokinantwort einzelner T-Zellph{\"a}notypen steigern k{\"o}nnen. MSCs scheinen daher am ehesten eine immunmodulatorische Rolle zu spielen, indem sie {\"u}bersteigerte Immunreaktionen herabsetzen und bei Bedarf immunstimulierend wirken.}, subject = {mesenchymal}, language = {de} } @phdthesis{Vogtmann2005, author = {Vogtmann, Alexandra}, title = {Vergleichende Untersuchungen zur automatisierten Auswertung von Elispot-Platten mit verschiedenen Bildanalysesystemen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18395}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, erstmals unterschiedliche automatisierte Bildanalysesysteme in der Auswertung von Elispot-Proben miteinander zu vergleichen. Neben dem Vergleich der Anzahl der gemessenen Spots, sollten die Zeit f{\"u}r die Messungen, die Genauigkeit, Richtigkeit und Pr{\"a}zision untersucht werden. Weiterhin sollten die Zuverl{\"a}ssigkeit der Messungen sowie die Einflussgr{\"o}ßen der einzelnen Bildanalysesysteme gepr{\"u}ft werden. Es wurden Elispotproben von verschiedenen Spezies (Maus und Human) und von verschiedenen unabh{\"a}ngigen Arbeitsgruppen verwendet. Die verglichenen Bildanalysesysteme bestanden aus den aufeinander abgestimmten Komponenten Mikroskop, Farbkamera, Motortisch mit Steuerung, Analysesoftware und Rechner. Sie unterschieden sich in ihren Mikroskopen, in der Anzahl der pro Well aufgenommenen Bilder und in der damit erreichten Bildpunktaufl{\"o}sung. Beim KS Elispot wurden im Auflichtmikroskop pro Well 12 Bilder {\"u}ber eine Farbkamera aufgenommen, die Bildpunktaufl{\"o}sung f{\"u}r ein 760x580 Pixel Bild eines Wells betrug 2.6µm. Beim KS Elispot compact 0.65-Zoom-Einstellung wurde im Stereomikroskop pro Well 1 Bild {\"u}ber eine Farbkamera aufgenommen und eine Bildpunktaufl{\"o}sung von 12µm erreicht. Beim KS Elispot 1.25-Zoom-Einstellung wurden im Stereomikroskop 4 Bilder pro Well {\"u}ber eine Farbkamera erstellt, die Bildpunktaufl{\"o}sung betrug 6µm. Im Bezug auf den Faktor Zeit war das KS Elispot compact dem KS Elispot deutlich {\"u}berlegen. Bei Verwendung eines Bildes pro Well bzw. 4 Bildern pro Well wertete das KS Elispot compact eine komplette 96-Well-Mikrotiterplatte bis zu 6 Mal schneller bzw. mindestens doppelt so schnell aus wie das KS Elispot. Die hohe Aufl{\"o}sung des KS Elispot resultiert in einer langen Auswertungszeit der einzelnen Platten. Werden große Mengen von Elispot-Proben ausgewertet, so bietet das KS Elispot compact aufgrund seiner k{\"u}rzeren Messzeiten eine deutliche Ersparnis an Zeit und damit gegen{\"u}ber dem KS Elispot unter diesem Gesichtspunkt einen entscheidenden Vorteil. Die Variabilit{\"a}t der Messungen lag bei allen Systemen niedrig, ohne nennenswerte Unterschiede zwischen den Systemen. Die h{\"o}chste Zuverl{\"a}ssigkeit bei der Spoterkennung konnte f{\"u}r das System KS Elispot nachgewiesen werden. Es erkannte nahezu alle echten Spots und mehr echte Spots als das KS Elispot compact. Das KS Elispot wies im Gegensatz zum KS Elispot compact keine falsch-positiven Spots auf. Bei Verwendung von 4 Bildern pro Well arbeitete das KS Elispot compact zuverl{\"a}ssiger als bei Erstellung von nur einer Aufnahme pro Well: der Anteil an falsch-positiven Spots am Ergebnis sank und der Anteil der richtig erkannten Spots stieg. Die Werte lagen jedoch immer noch unterhalb der Ergebnisse, die das KS Elispot erzielt hatte. Das KS Elispot compact erkannte grunds{\"a}tzlich in denselben Wells weniger Spots als das KS Elispot, das der tats{\"a}chlichen Anzahl der Spots am n{\"a}chsten kam. Bei Verwendung von nur einer Aufnahme pro Well identifizierte das KS Elispot compact deutlich weniger Spots als bei Aufnahme von 4 Bildern pro Well. Die deutlichsten Unterschiede zwischen den beiden Systemen KS Elispot und KS Elispot compact wurden bei der Messung durch das KS Elispot compact mit einem Bild pro Well bei Spotzahlen {\"u}ber 100 bei Mausspots und {\"u}ber 400 bei Humanspots gesehen. Die zwischen dem KS Elispot und dem KS Elispot compact nachgewiesenen Unterschiede waren bei kleinen Spots (bis 100µm) deutlich gr{\"o}ßer als bei Spots gr{\"o}ßerer Durchmesser. Der Vergleich der Systeme erbrachte, dass das hochaufl{\"o}sende KS Elispot eine bessere Auswertungsqualit{\"a}t als das KS Elispot compact bietet, insbesondere bei der Auswertung von Elispot-Proben, die sehr viele und zudem sehr kleine Spots enthielten. Beim KS Elispot compact war die Messung mit 4 Bildern pro Well der Auswertung mit nur einem Bild pro Well bez{\"u}glich der Zuverl{\"a}ssigkeit klar {\"u}berlegen. Bei Verwendung des KS Elispot compact sollte deshalb bei sehr kleinen Spots zumindest die mit 4 Bildern pro Well arbeitende Einstellung gew{\"a}hlt werden. Weiterhin ist zu bemerken, dass eine optimale Auswertung von Elispot-Proben durch automatisierte Reader-Systeme maßgeblich durch die Pr{\"a}paration der verwendeten Elispot-Proben und die daraus resultierende Qualit{\"a}t der Spots beeinflusst wird. Zahlreiche Artefakte, eine starke Untergrundf{\"a}rbung oder nicht deutlich ausgebildete typische Spotmerkmale k{\"o}nnen die Messergebnisse eines Systems beeintr{\"a}chtigen. Hierbei wurde das KS Elispot compact System st{\"a}rker beeinflusst als das KS Elispot System. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Auswertung der Elispot-Proben und damit die gewonnenen Ergebnisse von dem verwendeten, automatisierten Lesesystem abh{\"a}ngen.Die Arbeit unterstreicht den hohen Stellenwert der Standardisierung, Validierung und Optimierung aller Komponenten der Elispot-Methode. Dies ist auch gerade in Bezug auf die Weiterentwicklung dieser Technik und die Er{\"o}ffnung von weiteren Einsatzspektren unerl{\"a}sslich.}, language = {de} }