@phdthesis{Meisner2005,
  author    = {Meisner, Anke Karla},
  title     = {Alpha-Dioxygenase aus Erbsen - Studien zu Expression und Enzym-Substrat-Interaktion},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14692},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das Enzym alpha-Dioxygenase (alpha-DOX) aus Erbsen (Pisum sativum) wurde mit folgenden Zielsetzungen untersucht: Isolierung und Charakterisierung der f{\"u}r die P. sativum alpha-DOX codierenden cDNA, {\"U}berproduktion der P. sativum alpha-DOX in Escherichia coli und nachfolgende Isolierung, Untersuchung der Interaktion der P. sativum alpha-DOX mit Fetts{\"a}uresubstraten sowie systematische Studie der Expression der P. sativum alpha-DOX w{\"a}hrend der Keimung und Entwicklung von Erbsenpflanzen. alpha-Dioxygenasen katalysieren in Pflanzen den Initialschritt der alpha-Oxidation von langkettigen Fetts{\"a}uren, die {\"u}ber die intermedi{\"a}re Bildung von (R)-2-Hydroperoxyfetts{\"a}uren f{\"u}hrt. Folgeprodukte dieser Reaktion sind die entsprechende (R)-2-Hydroxys{\"a}ure sowie der um ein C-Atom kettenverk{\"u}rzte Aldehyd. Es wurde die f{\"u}r die alpha-Dioxygenase aus Erbsen codierende cDNA mit einer Gesamtl{\"a}nge von 2132 bp isoliert, die ein offenes Leseraster von 1929 bp beinhaltet. Sie codiert f{\"u}r ein Protein mit 643 Aminos{\"a}uren und einem errechneten Molekulargewicht von ca. 73 kD. Die Pisum sativum alpha-Dioxygenase wurde in E. coli als Fusionsprotein mit einem 6 x His-tag {\"u}berproduziert und mittels Metallaffinit{\"a}tschromatographie an Ni-NTA-Agarose isoliert. Studien zur Interaktion der P. sativum alpha-Dioxygenase mit Fetts{\"a}uresubstraten umfassten sowohl Versuche zu Anforderungen auf Seiten des Substrats als auch zu potentiellen Interaktionspartnern auf Seiten des Enzym. Es wurde gezeigt, dass f{\"u}r die Reaktion von alpha-Dioxygenasen mit Fetts{\"a}uren die freie Carboxylgruppe des Substrats unerl{\"a}sslich ist. Aufgrund eines Aminos{\"a}uresequenzvergleichs zwischen der alpha-Dioxygenase aus Erbsen und PGHS-1 aus O. aries wurden vier Aminos{\"a}uren als potentielle Interaktionspartner auf Seiten der alpha-Dioxygenase aus Erbsen ausgew{\"a}hlt. Es handelte sich um die Arginin-Reste Arg-87, Arg-391, Arg-569 und Arg-570. Mit Hilfe der ortsspezifischen Mutagenese wurde gezeigt, dass der Aminos{\"a}urerest Arg-570 f{\"u}r die katalytische Aktivit{\"a}t unerl{\"a}sslich ist. Die Expression der P. sativum alpha-Dioxygenase in keimenden Erbsen und jungen Erbsenpflanzen wurde sowohl in ihrem zeitlichen Verlauf als auch hinsichtlich der Gewebespezifit{\"a}t betrachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass Keimung zu einer deutlichen Akkumulation von alpha-Dioxygenase mRNA in Erbsen f{\"u}hrte. Auch alpha-Dioxygenase Protein war in großer Menge in keimenden und jungen Erbsenpflanzen vorhanden. Ausgepr{\"a}gte Gewebespezifit{\"a}t war festzustellen: alpha-DOX mRNA fand sich fast ausschließlich in Wurzeln von Erbsenpflanzen, in Sprossgewebe dagegen war sie kaum vorhanden. Im Gegensatz dazu lag alpha-DOX Protein gleichermaßen in Spross- und in Wurzelgewebe vor. Parallel zur Reifung der Pflanzen nahm die Menge an alpha-DOX mRNA und Protein ab. Alpha-Dioxygenase-Aktivit{\"a}t war bereits in trockenen Samen detektierbar, w{\"a}hrend der Keimung nahm sie deutlich zu. Im Vergleich von Spross- und Wurzelgewebe war die Aktivit{\"a}t in Wurzeln h{\"o}her, bezogen sowohl auf das Frischgewicht der Pflanzen als auch auf die Menge an Gesamtprotein (spezifische Aktivit{\"a}t). Die Untersuchungen an Wurzeln zeigten, dass die Aktivit{\"a}t bezogen auf das Frischgewicht der Pflanzen {\"u}ber den betrachteten Zeitraum kaum variierte, w{\"a}hrend die spezifische Aktivit{\"a}t mit zunehmendem Alter der Pflanzen kontinuierlich zunahm. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass in Erbsen mehrere alpha-Dioxygenase-Isoenzyme vorhanden sind, so wie man dies f{\"u}r andere h{\"o}here Pflanzen bereits postuliert hat. Ein zellprotektiver Effekt von alpha-Dioxygenasen auf Pflanzen w{\"a}hrend der Interaktion mit Pathogenen ist bekannt. M{\"o}glicherweise ist dies auch der Grund f{\"u}r eine verst{\"a}rkte Expression w{\"a}hrend der Keimung von Pflanzen. Die bevorzugte Expression in Wurzeln k{\"o}nnte auf eine Funktion als permanentes Schutzsystem gegen Infektion hindeuten.},
  subject      = {Erbse},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Weismann2002,
  author    = {Weismann, Dirk Thorsten},
  title     = {Untersuchungen zum enzymatischen und immunchemischen Nachweis der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase in CHO-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8064},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde nach Wegen gesucht, den Import peroxisomaler Matrixproteine, der {\"u}ber ein peroxisomales Targeting Signal Typ 2 gesteuert wird, zu messen. Es war vorgesehen, in erster Linie einen enzymchemischen Nachweis zu etablieren, da diese Methode den Vorteil einer Quantifizierbarkeit der Aktivit{\"a}t der gemessenen Enzyme bietet und somit R{\"u}ckschl{\"u}sse auf den Grad einer Beeintr{\"a}chtigung des Importes zulassen w{\"u}rden. Von dem Test wurde eine Sensitivit{\"a}t gefordert, die eine Messung auch in Homogenaten kultivierter Zellen, insbesondere von CHO-Zellen, erlaubt. Dieses war deswegen gefordert, weil der Test zur Charakterisierung induzierter CHO-Zell-Mutanten eingesetzt werden sollte, die die Merkmale eines PTS 2-Import-Defektes aufweisen. Dieser Nachweis sollte durch eine Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase erfolgen. Dieses Enzym ist eines von drei derzeit bekannten Proteinen, die eine PTS 2 besitzen und {\"u}ber diesen Weg importiert werden. Das Substrat f{\"u}r die Hydroxylase war als Phytans{\"a}ure mit einer 2,3-3H-Markierung in der Arbeitsgruppe vorr{\"a}tig und wurde f{\"u}r den Test zum CoA-Thioester chemisch umgesetzt. Nach erfolgter enzymatischer Umsetzung von Phytonoyl-CoA zu a-Hydroxyphytanoyl-CoA durch die Hydroxylase waren dann sowohl Edukt wie auch das Produkt durch eine radioaktive Markierung gekennzeichnet und konnten nach einer d{\"u}nnschicht-chromatographischen Trennung {\"u}ber Kieselgel durch einem Radiod{\"u}nnschichtscanner nachgewiesen werden. Zun{\"a}chst wurde mit Hilfe von Homogenaten aus Rattenlebergewebe ein bereits beschriebenes Verfahren zur Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase optimiert. Es stellte sich jedoch heraus, daß die Sensitivit{\"a}t dieses Testes nicht hoch genug ist, um die Hydroxylase-Aktivit{\"a}t in Homogenaten kultivierter CHO-Zellen zu messen. An dieser Stelle wurde die Etablierung eines immunchemischen Nachweises begonnen. Hierzu sollten Antik{\"o}rper gegen die Hydroxylase des chinesischen Zwerghamsters, des Ursprungsorganismus der CHO-Zellen, generiert werden. Eine Reinigung des Enzyms kam nicht in Betracht, weil die Hamster nicht im Labortierhandel erh{\"a}ltlich waren. Folglich musste die cDNA der Hydroxylase aus einer Hamster-cDNA-Bank kloniert werden, nachdem sie durch ihre bekannten Homologe aus Mensch und Maus identifizierbar war. In den verf{\"u}gbaren cDNA-Banken fand sich keine vollst{\"a}ndige Sequenz, so daß mit einer partiellen Sequenz ohne 5´-Ende weitergearbeitet werden musste. Es bot sich im Institut die M{\"o}glichkeit, aus dieser Sequenz Pepetide zu bestimmen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit stark immunogen wirken. Solche Peptide wurden synthetisiert und nach Koppelung an Tr{\"a}gerproteine neuseel{\"a}ndischen weißen Kaninchen geimpft. Im Elisa wies das Antiserum zum Zeitpunkt seiner Gewinnung einen Titer von etwa 1:10000 auf, zeigte aber im Westernblot neben einer starken Detektion in Laufweite der Hydroxylase auch eine unspezifische Anf{\"a}rbung der Proben. In der nun durchgef{\"u}hrten Affinit{\"a}tsreinigung des Antiserums {\"u}ber einer mit den antigenen Peptiden beladenen S{\"a}ule tauchte das Problem auf, daß die Antik{\"o}rper so fest binden, daß sie von ihren Antigenen nicht mehr ohne dentaturierende Bedingungen zu l{\"o}sen waren. F{\"u}r die weitere Arbeit sollte sich nun eine affinit{\"a}tschromatographische Reinigung {\"u}ber Peptide, die den Antik{\"o}rper mit geringerer Avidit{\"a}t binden, anschließen, so daß nach Trennung der Immunkomplexe native Antik{\"o}rper isoliert werden k{\"o}nnten. Hierzu w{\"a}re ein Epitop-mapping w{\"u}nschenswert, damit auf dieser Grundlage Peptide mit den geforderten Eigenschaften synthetisiert werden k{\"o}nnen.},
  language  = {de}
}