@phdthesis{Lichter2023,
  author    = {Lichter, Katharina},
  title     = {Die Ultrastruktur von Aktiven Zonen in hippocampalen Moosfaserboutons},
  doi       = {10.25972/OPUS-30312},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-303126},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {In nervous systems, synapses precisely orchestrate information transfer and memory formation. Active zones (AZ) are specialized subcellular compartments at the presynaptic mesoscale which process synaptic transmission on an ultrastructural level. The AZ cytomatrix including the essential scaffold protein Rab3 interacting molecule (RIM) enables exocytosis of synaptic vesicles. A deficiency of the locally most abundant protein isoform RIM1α diminishes long-term potentiation in a complex central mammalian synapse - the connection of hippocampal mossy fiber boutons (MFB) to cornu ammonis (CA)3 pyramidal neurons. Behaviourally, these mice present with learning impairment. The present MD thesis addresses the so far unknown three-dimensional (3D) AZ ultrastructure of MFBs in acute hippocampal slices of wild-type and RIM1α-/- mice. In a first set of experiments, a standardized protocol for near-to-native synaptic tissue preparation at MFBs using high-pressure freezing and freeze substitution and 3D modelling using electron tomography was developed and established. Based on the excellent preservation of synaptic tissue using this protocol, the AZ ultrastructure in both genotypes was quantified in detail up to an individual docked synaptic vesicle using custom-written programming scripts. The experiments demonstrate that deficiency of RIM1α leads to multidimensional alter-ation of AZ 3D ultrastructure and synaptic vesicle pools in MFBs. (Tightly) docked synaptic vesicles - ultrastructural correlates of the readily releasable pool - are reduced, decentralized, and structurally modified, whereas the more distant vesicle pool clusters more densely above larger and more heterogenous AZ surfaces with higher synaptic clefts. The present thesis contributes to a more comprehensive understanding regarding the role of RIM1α for (tight) vesicle docking and organization at MFBs. Furthermore, the precise 3D ultrastructural analysis of MFB AZs in this thesis provides the necessary mor-phological basis for further studies to correlate synaptic ultrastructure with presynaptic plasticity and memory dysfunction in RIM1α-/- mice using advanced electrophysiological and behavioral techniques.},
  subject      = {Hippocampus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Paul2014,
  author    = {Paul, Mila Marie},
  title     = {Vesikelverkehr in Aktiven Zonen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-110791},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Aktive Zonen (AZs) sind hoch spezialisierte, subzellul{\"a}re Kompartimente von Neuronen, die der synaptischen {\"U}bertragung dienen. Sie enthalten Ger{\"u}stproteine wie RIM (Rab3 interacting molecule) sowie elektronendichte Projektionen bestehend aus Bruchpilot bei Drosophila melanogaster oder Bassoon im S{\"a}uger, welche Schl{\"u}sselkomponenten des Vesikelverkehrs darstellen. Bei der Fliege sind Anzahl und Verteilung von Bruchpilot-Molek{\"u}len in AZs relevant f{\"u}r die funktionelle Differenzierung. Ihre Anordnung wird im Abstand von weniger als einem Mikrometer innerhalb einer pr{\"a}synaptischen Endigung reguliert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden elektrophysiologische Ableitungen und konfokale sowie h{\"o}chstaufl{\"o}sende, immunhistochemische Bildgebung mit dem dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Verfahren an larvalen, neuromuskul{\"a}ren Synapsen von Drosophila durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde das genetische Potenzial des Modellorganismus genutzt, um relevante Proteinfunktionen und -interaktionen zu analysieren. RIM als zentrale Komponente Aktiver Zonen ist relevant f{\"u}r synaptische Plastizit{\"a}t. Eine als CORD7 (cone-rod dystrophy type 7) bezeichnete Punktmutation (Arginin zu Histidin) innerhalb der 310 Helix der C2A-Dom{\"a}ne von RIM wurde mit erh{\"o}hten kognitiven F{\"a}higkeiten einer Patientengruppe in Verbindung gebracht. Weil die Drosophila C2A-Dom{\"a}ne eine hohe Homologie zur S{\"a}ugerdom{\"a}ne aufweist, konnte der Einfluss dieser Mutation auf Struktur und Funktion von Synapsen untersucht werden. Es zeigte sich, dass der Aminos{\"a}ureaustausch der CORD7-Position und des benachbarten Arginin-Restes die synaptische Organisation und Transmission beeinflussen. In einer Reihe weiterer Experimente wurde das Zusammenspiel von Bruchpilot und Synaptotagmin, dem Calciumsensor der evozierten Transmitterfreisetzung, analysiert. W{\"a}hrend AZs ohne Bruchpilot auch ohne Synaptotagmin funktionieren, f{\"u}hrt dessen Reduktion zu einer Umverteilung von Bruchpilot-Molek{\"u}len innerhalb von AZs und zu dramatischen {\"A}nderungen in ihrer Anzahl. Abschließend wurde so ein Beitrag zum Verst{\"a}ndnis der molekularen Organisation synaptischer Informationsverarbeitung und Plastizit{\"a}t geleistet, wobei zu kl{\"a}ren bleibt, wie die zuverl{\"a}ssige Speicherung von Informationen an AZs erreicht werden kann.},
  subject      = {Aktive Zonen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pauli2012,
  author    = {Pauli, Martin},
  title     = {Bildgebung Aktiver Zonen : Lichtmikroskopische Methoden zur Darstellung pr{\"a}synaptischer AktiverZonen in lebendem und fixiertem Gewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77630},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Ver{\"a}nderungen pr{\"a}synaptischer Aktiver Zonen als m{\"o}gliches Korrelat synaptischer Plastizit{\"a}t zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizit{\"a}t Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Ged{\"a}chtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Ver{\"a}nderung in vitalem Gewebe erm{\"o}glichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuf{\"u}hren, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgepr{\"a}gte pr{\"a}synaptische Plastizit{\"a}t aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es m{\"o}glich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzf{\"a}rbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Aufl{\"o}sungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gel{\"o}st werden konnte. Um eine pr{\"a}zise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochaufl{\"o}sende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen r{\"a}umlichen Aufl{\"o}sung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgepr{\"a}gte Plastizit{\"a}t, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Pr{\"a}parat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskul{\"a}re Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Pr{\"a}parat f{\"u}r dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die M{\"u}ndungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgel{\"o}st werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Aufl{\"o}sung erm{\"o}glichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei erm{\"o}glicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molek{\"u}lanzahl.},
  subject      = {Hippokampus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Jauch2010,
  author    = {Jauch, Mandy},
  title     = {Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche - Aktive Zonen (AZs) genannt -, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie f{\"u}r den Prozess der Neurotransmitter-Aussch{\"u}ttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein f{\"u}r die T-f{\"o}rmigen B{\"a}nder („T-Bars") der pr{\"a}synaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig f{\"u}r eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeintr{\"a}chtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von S{\"a}ugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolution{\"a}r hoch konservierte zweigeteilte Kinasedom{\"a}ne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolution{\"a}r hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren geh{\"o}ren und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) f{\"u}hrt zu auff{\"a}lligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter B{\"a}nder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gew{\"a}hrleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antik{\"o}rpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier m{\"o}glichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Ph{\"a}notyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer {\"U}berexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In K{\"o}pfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich ver{\"a}ndert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der pr{\"a}synaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf ver{\"a}ndertes Spleißen der entsprechenden pr{\"a}-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente f{\"u}r die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugf{\"a}higkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunf{\"a}higen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelf{\"a}rbungen mit Antik{\"o}rpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neuroh{\"a}mal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Aussch{\"u}ttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose m{\"o}glicherweise eine Rolle bei der Aussch{\"u}ttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei F{\"a}rbung gegen BRP weist keine deutlichen Ver{\"a}nderungen zum Wildtyp auf.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}