@phdthesis{Nowotny2012,
  author    = {Nowotny, Boris},
  title     = {Etablierung von zellul{\"a}ren Testsystemen f{\"u}r die Identifizierung von neuartigen Inhibitoren des HIV-1 Vif-induzierten APOBEC3G-Abbaus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70477},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Als einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zellul{\"a}re Enzym hemmt {\"a}ußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterf{\"u}hrende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation haupts{\"a}chlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms w{\"a}hrend der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eine direkte Wechselwirkung den Ubiquitin-abh{\"a}ngigen proteasomalen Abbau von A3G bewirkt. Vor diesem Hintergrund wird der Inhibition des Vif induzierten A3G- Abbaus großes Potential als neuartiges Wirkstoffziel bei der Behandlung von HIV Infektionen vorhergesagt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Etablierung von zellul{\"a}ren Screening-Assays f{\"u}r die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt vier fluoreszenzbasierte zellul{\"a}re Assays erfolgreich entwickelt und als Screeningsysteme f{\"u}r die Wirkstoffsuche etabliert werden. Drei dieser Assays basieren auf stabilen Zelllinien, von denen eine Vif und ein mit EYFP markiertes A3G ko-exprimiert. Dieser sogenannte A3G-Abbauassay stellt den prim{\"a}ren Assay f{\"u}r die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus dar und wird durch zwei weitere Zelllinien-basierte Assays erg{\"a}nzt. Diese sekund{\"a}re Assays erlauben die Detektion von Substanzen, die falsch-positive oder falsch-negative Signale im A3G-Abbauassays generieren. Zusammengenommen erm{\"o}glichen die drei Assays die pr{\"a}zise Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch auf den A3G-Abbau wirken und stellen damit eine wesentliche Verbesserung bereits existierender Screeningsysteme dar. Weiterhin wurde ein auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) basierendes Testsystem entwickelt. Besagtes System misst die direkte Interaktion zwischen Vif und ElonginC in lebenden Zellen und repr{\"a}sentiert damit ein weiteres Testsystem f{\"u}r die Identifizierung von Inhibitoren der Vif induzierten A3G-Degradation. Den zweiten Teil dieser Arbeit umfasste die Analyse von Derivaten des Vif Antagonisten RN-18 und neu entwickelten niedermolekularen Inhibitoren der Vif-ElonginC- Interaktion. Als ein wichtiges Ergebnis der Derivat-Analyse ergab sich, dass RN-18 zytotoxisch wirkt und im hier etablierten A3G-Abbauassay ein falsch-positives Signal generiert. Unter den analysierten Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren fand sich eine Verbindung, die in einem initialen Screening, unter Verwendung des A3G-Abbauassays, eine deutliche Inhibition der Vif induzierten A3G-Degradation bewirkte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Promotionsprojektes erfolgreich mehrere Screeningsysteme f{\"u}r die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren des A3G-Abbaus etabliert werden. Diese Systeme werden zuk{\"u}nftig dazu beitragen, dass Auffinden von neuartigen Therapeutika f{\"u}r die Behandlung von HIV-Infektionen zu beschleunigen.},
  subject      = {Inhibitor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fehrholz2011,
  author    = {Fehrholz, Markus},
  title     = {APOBEC3G-vermittelte Hemmung der Masernvirus-Replikation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56143},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Das Masernvirus (MV) ist ein negativ-str{\"a}ngiges RNA-Virus aus der Familie der Paramyxovi-ridae und z{\"a}hlt immer noch zu den h{\"a}ufigsten Todesursachen bei Kindern in Entwicklungs-l{\"a}ndern. Nach dem Eintritt in den K{\"o}rper f{\"u}hrt eine Infektion von CD150-exprimierenden B- und T-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs) und Monozyten bzw. Makrophagen zu einer systemischen Infektion. Viele Mitglieder der Familie der APOBEC-Proteine („apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins"), u. a. auch APOBEC3G, werden als Teil der angeborenen Immunantwort in diesen Zellen und infizierten Geweben exprimiert. In fr{\"u}heren Studien wurde bereits gezeigt, dass diese Proteine durch ihre RNA-bindenden Eigenschaften und ihre F{\"a}higkeit zur Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu einer Inhibition von verschiedenen Retroelementen und Retroviren, wie beispielsweise den „long interspersed nuclear elements 1" und dem humanen Im-mundefizienz-Virus (HIV) f{\"u}hren. Das Ziel dieser Arbeit war es, m{\"o}gliche antivirale Mechanismen von humanem APOBEC3G gegen das MV als Vertreter der negativ-str{\"a}ngigen RNA-Viren zu identifizieren. Hierzu wurden rekombinante MV-Wildtyp und -Impfst{\"a}mme, sowie APOBEC3G-{\"u}berexprimierende Vero-Zelllinien verwendet. Es zeigte sich, dass die Replikation des verwendeten rekombinanten Masern Wildtyp- und Impfvirus durch humanes APOBEC3G inhibiert wird. Diese Inhibition {\"a}ußerte sich in einer reduzierten Synzytienbildung, einer mindestens 50 \%igen Reduktion viral-exprimierter Proteine, sowie in einer 90-99 \%igen Reduktion der auf APOBEC3G-exprimierenden Zellen entstandenen viralen Titer. Durch Sequenzanalysen konnte festgestellt werde, dass es zu einem Anstieg von 0,2 auf 0,95 unspezifischer Mutationen pro 1.000 Basenpaaren in MV-Transkripten kam, deren Muster mit dem in Kontrollzellen vergleichbar war, wohingegen typische C zu U(T) bzw. G zu A Hypermutationen nicht auftraten. Eine Kolokalisation von humanem APOBEC3G mit MV-spezifischen Proteinen konnte ebenfalls nicht eindeutig beobachtet werden. Es zeigte sich allerdings, dass APOBEC3G an virale RNA binden konnte. Außerdem wurde APOBEC3G in aufgereinigten viralen Partikeln um etwa den Faktor 4 angereichert. Versuche mit einem MV-Minireplikon-System ergaben, dass APOBEC3G eine Inhibition der viralen RNA-abh{\"a}ngigen RNA-Polymerase bewirkt, vermutlich aufgrund der F{\"a}higkeit des Proteins an virale RNA zu binden. Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen mit mutierten APOBEC3G-Proteinen haben auch in die-ser Arbeit erneut belegt, dass der RNA-bindenden Desaminase-Dom{\"a}ne bei der zellul{\"a}ren Lokalisation des Proteins eine besondere Rolle zukommt, da einige Mutationen innerhalb dieses Bereiches zu einem hohen Verlust der Proteinexpression sowie zu einer Ansammlung der mutierten Proteine am rauen endoplasmatischen Retikulum f{\"u}hren. Die in dieser Arbeit gezeigte Inhibition der Replikation von MV durch humanes APO-BEC3G l{\"a}sst eine generelle antivirale Aktivit{\"a}t von Mitgliedern der APOBEC-Familie gegen negativ-str{\"a}ngige RNA-Viren vermuten, welche auf der F{\"a}higkeit des Proteins beruht RNA zu binden. Weitere Untersuchungen bez{\"u}glich der Inhibition anderer Vertreter der Mononegavirales durch verschiedene APOBEC-Proteine k{\"o}nnten Aufschluss {\"u}ber die beteiligten Mechanismen geben.},
  subject      = {RNS-Bindung},
  language  = {de}
}