@phdthesis{Wein2001,
  author    = {Wein, Martina},
  title     = {Biosynthese und Metabolismus von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon in Erdbeeren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1182059},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit pr{\"a}sentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorl{\"a}ufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis {\"u}ber den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit R{\"u}ckschl{\"u}sse {\"u}ber die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als m{\"o}gliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorl{\"a}ufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erh{\"a}ltlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erh{\"o}hung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegen{\"u}ber dem nat{\"u}rlichen Isotopenverh{\"a}ltnis festgestellt. Somit k{\"o}nnen 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorl{\"a}ufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen h{\"o}heren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschl{\"u}sse {\"u}ber den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erkl{\"a}rbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate {\"u}berf{\"u}hrt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF g{\"a}nzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erkl{\"a}ren ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unver{\"a}ndert vorliegen k{\"o}nnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollst{\"a}ndige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierf{\"u}r wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollst{\"a}ndige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den h{\"o}chsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Bl{\"a}tter, St{\"a}ngel und Bl{\"u}te konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffees{\"a}ure-OMTs aus Weidengew{\"a}chsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifit{\"a}t des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundger{\"u}st, wie Brenzcatechin, Kaffees{\"a}ure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffees{\"a}ure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffees{\"a}ure oder 5-Hydroxyferulas{\"a}ure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitb{\"u}ndeln und verst{\"a}rkt in den Achenen lignifiziert sind, erkl{\"a}rt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle {\"A}hnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivit{\"a}t zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Prim{\"a}re Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitb{\"u}ndel und sp{\"a}ter die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein.},
  subject      = {Erdbeere},
  language  = {de}
}