@phdthesis{Troge2012,
  author    = {Troge, Anja},
  title     = {Studien am Flagellensystem des Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (EcN) im Hinblick auf seine Funktion als Probiotikum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74201},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) geh{\"o}rt zu den am besten untersuchten und charakterisierten probiotischen Bakterienst{\"a}mmen. Seit Beginn des letzten Jahrhunderts wird er als Medikament eingesetzt, um verschiedene Darmerkrankungen wie z.B. Diarrh{\"o}e, entz{\"u}ndliche Darmerkrankungen und Verstopfung zu behandeln. Die Flagelle des EcN vermittelt Beweglichkeit und kann die Produktion von humanem β-Defensin 2 (hBD2) durch Epithelzellen induzieren. Somit ist dieses Organell direkt in die probiotische Funktion des EcN involviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Flagellen anderer Bakterien, wie z.B. dem probiotischen Stamm Bacillus cereus CH oder den pathogenen St{\"a}mmen Pseudomonas aeruginosa und Clostridium difficile, die Adh{\"a}sion an intestinalen Mucus, welcher von Epithelzellen sekretiert wird, vermitteln. Allerdings blieb unklar, welcher Teil der Flagelle an welche Mucuskomponente bindet. Die F{\"a}higkeit effizient an Wirtgewebe zu adh{\"a}rieren wird als wichtiges Attribut eines probiotischen Stammes angesehen. Ex vivo Adh{\"a}sionsstudien mit Kryoschnitten humaner Darmbiopsien haben gezeigt, dass die Flagelle des EcN in die effiziente Adh{\"a}sion an humanes Darmgewebe involviert sein muss. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Funktion der Flagelle des EcN als Adh{\"a}sin untersucht. Zun{\"a}chst wurde die hyperflagellierte Variante EcN ATHF isoliert und durch verschiedene Experimente, z.B. Schw{\"a}rmagartests und Elektronenmikroskopie, charakterisiert. Weitere ex vivo Adh{\"a}sionsstudien mit EcN ATHF zeigten eine h{\"o}here Adh{\"a}sionseffizienz dieser hyperflagellierten Variante und best{\"a}tigten damit die Rolle der Flagelle bei der effizienten Adh{\"a}sion von EcN an die Kryoschnitte der humanen Darmbiopsien. Interessanterweise fungierte die Flagelle in in vitro Studien mit den humanen Epithelzellen Caco-2 und T24 nicht als Adh{\"a}sin. Diese Unterschiede zwischen den in vitro und ex vivo Studien f{\"u}hrten zu der Annahme, dass die Flagelle des EcN in vivo die Adh{\"a}sion an Mucus vermittelt, welcher von den Caco-2- und T24-Zellen nicht produziert wird, aber in den Kryoschnitten der Darmbiopsien nachgewiesen wurde. Diese Vermutung wurde durch in vitro Adh{\"a}sionsstudien mit der Mucin-produzierenden Epithelzelllinie LS174-T best{\"a}tigt, da die Flagellen f{\"u}r eine effektive Adh{\"a}sion an diese Zellen essentiell waren. Zudem reduzierte die Pr{\"a}inkubation flagellierter EcN-St{\"a}mme mit Mucin2 ihre Adh{\"a}sionseffizienz an Kryoschnitte humaner Darmbiopsien. Um die direkte Interaktion zwischen Flagellen des EcN Wildtyps und Mucus zu zeigen, wurde ein ELISA etabliert. Es konnte eine direkte konzentrationsabh{\"a}ngige Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und Mucin2, bzw. humanem Mucus (Kolon) beobachtet werden. Interessanterweise konnte keine Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und murinem Mucus (Duodenum, Ileum, Caecum, Colon) festgestellt werden. Dies weist darauf hin, dass die Mucuszusammensetzung zwischen verschiedenen Spezies variiert. Verschiedene Kohlenhydrate, welche bekannte Mucusbestandteile sind, wurden auf ihre Interaktion mit der Flagelle von EcN getestet und Gluconat wurde als ein Rezeptor identifiziert. Die Pr{\"a}inkubation isolierter Flagellen mit Gluconat reduzierte ihre Interaktion mit Mucin2, bzw. humanem Mucus signifikant. Zudem wurde die oberfl{\"a}chenexponierte Dom{\"a}ne D3 des Flagellins, der Hauptuntereinheit der Flagelle, als m{\"o}glicher Interaktionspartner von Mucin2, bzw. humanem Mucus ausgeschlossen. Flagellen, die aus einer Dom{\"a}ne D3 Deletionsmutante isoliert wurden, zeigten sogar eine effizientere Bindung an Mucin2, bzw. humanen Mucus. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass {\"A}nderungen des pH-Wertes signifikante Effekte auf die Interaktion zwischen Mucus und isolierten Flagellen hatten, vermutlich aufgrund von Konformations{\"a}nderungen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Flagelle als neues und scheinbar wichtigstes Adh{\"a}sin in vivo f{\"u}r den probiotischen Stamm EcN identifiziert. Hierf{\"u}r wurden sowohl eine hyperflagellierte Variante, eine ΔfliC Mutante, sowie der dazugeh{\"o}rige komplementierte Stamm verwendet. EcN ist zudem der erste probiotische Stamm f{\"u}r den eine direkte Bindung der Flagellen an humanen Mucus nachgewiesen werden konnte. Die Mucuskomponente Gluconat konnte dabei als wichtiger Rezeptor identifiziert werden. Da einige pathogene Bakterien ihre Flagelle zur Adh{\"a}sion an Wirtsgewebe nutzen, k{\"o}nnte dieses Organell EcN dazu bef{\"a}higen, mit Pathogenen um die erfolgreiche Kolonisierung des Darms zu konkurrieren, was als wichtige Eigenschaft eines Probiotikums betrachtet wird.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schiller2014,
  author    = {Schiller, Roswitha Dorothee},
  title     = {Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre liefern immer mehr Hinweise darauf, dass eine klare Unterscheidung von Fitness- und Virulenzfaktoren in vielen F{\"a}llen, insbesondere bei extraintestinal pathogenen Escherichia coli, nicht m{\"o}glich ist. So l{\"a}sst sich auch bei Harnwegsinfektionen verursachenden E. coli den bakteriellen und teils stammspezifischen Faktoren oftmals nicht eindeutig eine typische Virulenz- oder Fitness-assoziierte Funktion zuordnen. Zudem werden in neueren Studien immer h{\"a}ufiger atypische uropathogene Isolate von E. coli beschrieben, die in ihrem „Virulenzrepertoire" deutlich von typischen uropathogenen E. coli (UPEC) abweichen, da sie keine klassischen UPEC-Virulenzfaktoren aufweisen. In dieser Arbeit wurden daher Virulenzeigenschaften typischer als auch atypischer UPEC untersucht. Der Effekt eines bestimmten bakteriellen Faktors auf den Wirtsorganismus wird teilweise indirekt durch sekund{\"a}re Modifikation bedingt. Dies offenbart sich beispielsweise am Autotransporterprotein AIDA-I, dessen Konformation durch posttranslationale Glykosylierung stabilisiert wird, wodurch es seine Funktionalit{\"a}t als Adh{\"a}sin erh{\"a}lt. Da bisherige Studien zum AIDA-I homologen Autotransporterprotein Antigen 43 (Ag43) auf der Analyse von k{\"u}nstlich glykosyliertem Protein basieren, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der nat{\"u}rlichen Glykosylierung von Ag43 in UPEC Stamm 536. Es zeigte sich, dass beide Ag43-Varianten von E. coli Stamm 536 nat{\"u}rlicherweise glykosyliert vorliegen, der Grad der Glykosylierung jedoch wesentlich geringer ausf{\"a}llt als bei nat{\"u}rlich glykosyliertem AIDA-I. Inwieweit die nat{\"u}rliche Glykosylierung von Ag43 zu dessen Funktionalit{\"a}t beitr{\"a}gt, kann erst durch die Identifizierung der f{\"u}r die Ag43-Glykosylierung verantwortlichen Glykosyltransferase gekl{\"a}rt werden. Die in silico-Analyse des Genoms von UPEC Stamm 536 f{\"u}r potentielle Glykosyltransferasen von Ag43 lieferte neun Kandidatengene. Die Gene wurde teils im Wildtyp-Hintergrund, teils im rfaH-negativen Hintergrund von E. coli Stamm 536 deletiert und die Mutanten im Anschluss ph{\"a}notypisch charakterisiert. Die Deletion der Kandidatengene waaF, waaG und waaQ, die f{\"u}r Glykosyltransferasen des LPS-Biosynthesesystems kodieren, f{\"u}hrte zu den deutlichsten Unterschieden in Bezug auf Motilit{\"a}t, Curli/Zellulose-Produktion, H{\"a}molyseaktivit{\"a}t und Expression von Typ 1 Fimbrien. Der Einfluss des „knock-out" der Kandidatengene auf die Glykosylierung von Ag43 muss in weiterf{\"u}hrenden Studien untersucht werden. Zur Charakterisierung des uropathogenen Virulenzpotentials verschiedener E. coli St{\"a}mme in vivo hat sich in den letzten Jahren das murine Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion etabliert. Mit Hilfe dieses Modells wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl spezifische Deletionsmutanten prototypischer UPEC als auch atypische E. coli Harnwegsisolate bez{\"u}glich ihrer Urovirulenz getestet und verglichen. Bei der Untersuchung der klassischen UPEC lag der Fokus auf der m{\"o}glichen Urovirulenzmodulation durch die folgenden spezifischen Faktoren: dem Autotransporterprotein Ag43, dem „Response regulator" UvrY, dem Polyketid Colibactin sowie dem Exopolysaccharid poly-β-1,6-N-Acetylglucosamin (PGA). F{\"u}r Ag43 war bei der Etablierung einer Harnwegsinfektion keine eindeutige Funktion feststellbar. Es ist jedoch denkbar, dass Ag43 zur Langzeitpersistenz im Harnwegstrakt beitragen kann, was in weiteren Studien belegt werden sollte. Die Expression von UvrY in der nat{\"u}rlichen uvrY-Deletionsmutante UPEC Stamm 536 ließ keine Erh{\"o}hung des Urovirulenzpotentials im Mausmodell erkennen. In diesem Zusammenhang konnte allerdings gezeigt werden, dass die Expression des Genotoxins Colibactin in UPEC Stamm 536 dessen Virulenz signifikant herabsetzte. Die Untersuchungen zur Relevanz des Exopolysaccharids PGA belegen deutlich, dass PGA f{\"u}r die Langzeitpersistenz von E. coli im murinen Harnwegstrakt ben{\"o}tigt wird. F{\"u}r die initiale Kolonisierung scheint PGA hingegen keine Bedeutung zu haben. F{\"u}r atypische UPEC Isolate, die Charakteristika von STEC und EAEC zeigen und sich in ihrem Virulenzmuster deutlich von prototypischen UPEC unterscheiden, ließ sich im murinen Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion, verglichen mit dem UPEC Modellorganismus 536, ein {\"a}hnliches, teils sogar erh{\"o}htes uropathogenes Virulenzpotential nachweisen. Die Ergebnisse der Arbeit untermauern somit die heutige Vorstellung bez{\"u}glich der Entwicklung und Etablierung einer Harnwegsinfektion, dass verschiedene E. coli St{\"a}mme unterschiedliche (Kontroll-) Mechanismen entwickelt haben, um erfolgreich den Harnwegstrakt kolonisieren und eine Infektion ausl{\"o}sen zu k{\"o}nnen. Zudem weisen sie darauf hin, dass diese F{\"a}higkeit nicht auf Isolate typischer phylogenetischer UPEC Entwicklungslinien beschr{\"a}nkt und auf das Vorhandensein charakteristischer UPEC Virulenzfaktoren angewiesen ist.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rund2014,
  author    = {Rund, Stefan A.},
  title     = {Interferenz des probiotischen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 mit Adh{\"a}sion, Replikation und Shiga Toxin Produktion von EHEC St{\"a}mmen in vitro},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-104837},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {E. coli Nissle 1917 (EcN) z{\"a}hlt durch seine fast hundertj{\"a}hrige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung w{\"a}hrend der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt. Der enteroaggregative - h{\"a}morrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland f{\"u}r den bisher gr{\"o}ßten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven M{\"o}glichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend ben{\"o}tigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli St{\"a}mme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adh{\"a}sion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen St{\"a}mme untersucht. Zus{\"a}tzlich wurde die Resistenz von EcN gegen{\"u}ber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen. Zun{\"a}chst wurde die Adh{\"a}sionseffizienz der verschiedenen E. coli St{\"a}mme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adh{\"a}rierende Stamm war EcN. Dies ist insofern {\"u}berraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adh{\"a}rieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adh{\"a}sion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enteroh{\"a}morrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier f{\"u}r einen Teil des beobachteten anti-adh{\"a}siven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli St{\"a}mme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli St{\"a}mme beeinflusst, identifiziert. Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC St{\"a}mmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am h{\"a}ufigsten auftretenden EHEC St{\"a}mme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt. Auff{\"a}llig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abh{\"a}ngig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abh{\"a}ngigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabh{\"a}ngige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgef{\"u}hrt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Molek{\"u}ls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat f{\"u}hrte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt. Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegen{\"u}ber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als m{\"o}glicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch best{\"a}tigt werden muss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli St{\"a}mme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend ben{\"o}tigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen k{\"o}nnen.},
  subject      = {EHEC},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Reidl2009,
  author    = {Reidl, Sebastian},
  title     = {Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Multizellul{\"a}re Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. H{\"a}ufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizellul{\"a}re Lebensweise von humanpathogenen Erregern zur{\"u}ckf{\"u}hren. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-St{\"a}mme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazellul{\"a}re polymere Substanzen, Adh{\"a}sine oder Oberfl{\"a}chen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft tr{\"a}gt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder {\"a}hnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit n{\"a}her untersucht worden. Hierf{\"u}r wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adh{\"a}sin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 \&\#916;fim\&\#916;flu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypst{\"a}mmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zus{\"a}tzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah ('Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase') durchgef{\"u}hrt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladh{\"a}sionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I ('Adhesin Involved in Diffuse Adherence') enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte f{\"u}r Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adh{\"a}sin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalit{\"a}t des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante f{\"u}hrte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinit{\"a}ten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazit{\"a}t des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Dom{\"a}nen anderer Autotransporter auf. F{\"u}r viele dieser Proteine konnte bereits eine adh{\"a}sive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine m{\"o}gliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollst{\"a}ndig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde f{\"u}r Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellul{\"a}ren Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erh{\"o}hter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint f{\"u}r die Funktionalit{\"a}t von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen erm{\"o}glicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur f{\"u}r die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abh{\"a}ngigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Reichardt2010,
  author    = {Reichardt, Elisabeth},
  title     = {Untersuchungen zur Verbreitung von Virulenzfaktoren extraintestinal pathogener Escherichia coli-St{\"a}mme bei Isolaten boviner Mastitiden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-53884},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {In dieser Arbeit werden die Ergebnisse der molekular-epidemiologischen Analyse von Virulenzgenen im Genom von insgesamt 222 Escherichia coli (E. coli)-Isolaten dargestellt, die von Mastitis-F{\"a}llen bei Rindern isoliert wurden. Mit Hilfe der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion wurde die Verbreitung von 42 potentiellen Virulenzfaktor-Genen extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) analysiert. Neben der quantitativen Bestimmung des Vorkommens jedes Einzelgens wurde in dieser Arbeit eine differenzierte Auswertung von Genkombinationen bei E. coli Mastitis-Isolaten vorgenommen. Diese ermittelten genetischen Muster werden zur 1. Pr{\"a}valenz der in der Gesamtheit der Isolate, 2. Pr{\"a}valenz in den phylogenetischen ECOR-Gruppen, 3. akut klinischen und chronischen Mastitis-Episoden und 4. dem Vorkommen spezifisch tierpathogener Adh{\"a}sine korreliert. Die Mastitis-Isolate konnten aufgrund der Virulenzmarkerverteilung und Phylogenie keinem bestimmten charakteristischen Pathotyp zugeordnet werden. Die {\"u}berwiegende Mehrzahl der Mastitis-Isolate zeigte aufgrund einer geringen Pr{\"a}valenz Virulenz-assoziierter Gene sowie der Zugeh{\"o}rigkeit zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A und B1 ein geringes Virulenzpotential extraintestinal pathogener E. coli. Die Mehrzahl der St{\"a}mme enthielt eine singul{\"a}re Virulenzdeterminante (83 St{\"a}mme; 37,4 \%), eine Zweierkombination (69 St{\"a}mme; 31,1 \%) oder eine Dreierkombination von Virulenzgenen (34 St{\"a}mme; 15,3 \%). Vier Gene f{\"u}r Virulenzfaktoren in Kombination zeigten sich lediglich in sieben St{\"a}mmen (3,1 \%). Insbesondere die Anwesenheit von 5 bis 18 differenten Virulenzgenen pro Genom traten nur mit einer geringen Frequenz in zusammen 16 Isolaten (7,2 \%) auf. Das absolut h{\"a}ufigste Virulenz-assoziierte Gen, das nachgewiesen wurde, war fimH, das f{\"u}r die mannosespezifische Adh{\"a}sinuntereinheit der Typ1-Fimbrien kodiert. Insgesamt gaben 88,7 \% aller 222 untersuchten St{\"a}mme ein positives Signal in der Multiplex-PCR, und zwar 89,9 \% der 199 klinischen Isolate sowie 85,7 \% der Isolate chronischer Mastitiden. In etwa der H{\"a}lfte aller untersuchten St{\"a}mme trat auch das Gen traT auf, das Serumresistenz vermittelt (43,7 \%). Die Genkombination fimH-traT wurde in wechselnden Konstellationen in insgesamt 83 St{\"a}mmen (37,3 \%) gefunden. Sie ist damit die h{\"a}ufigste Virulenzgenkombination in den untersuchten E. coli-Genomen mit multiplen Virulenzdeterminanten. Da bei Rinder-Mastitis besonders in den schweren F{\"a}llen systemische Verl{\"a}ufe f{\"o}rdernde Faktoren wie Serumresistenz eine bedeutende Rolle spielen, k{\"o}nnte hier eine Selektion auf genetische Kopplung von traT mit fimH vorliegen. Deutlich geringere Pr{\"a}valenzen wiesen die Virulenzgene f{\"u}r α-H{\"a}molysin (hlyA, 10,8 \%), den Yersiniabactinrezeptor (fyuA, 12,2 \%) sowie das ebenfalls an der Serumresistenz beteiligte Gen iss (8,5 \%) auf. Nur 13 (5,8 \%) der 222 E. coli-Isolate besaßen keines der untersuchten Virulenzgene. Das Fehlen bekannter Virulenzgene in diesen St{\"a}mmen deutet darauf hin, dass weitere unber{\"u}cksichtigte Faktoren eine Rolle bei der Virulenz von Mastitisisolaten spielen k{\"o}nnten oder der Status des Wirtsorganismus in diesen F{\"a}llen ausschlaggebend f{\"u}r eine erfolgreiche Infektion des Euters sein k{\"o}nnte. Offensichtlich sind die meisten der untersuchten E. coli- Virulenzfaktoren f{\"u}r die Pathogenese der Rindermastitis von untergeordneter Bedeutung. Von den 222 Isolaten z{\"a}hlten insgesamt 137 St{\"a}mme zur phylogenetischen Linie (ECOR-Gruppe) A, 62 zur ECOR-Gruppe B1, 20 zur ECOR-Gruppe B2 und 14 zur Gruppe D. Die St{\"a}mme, die zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A, B1 und D geh{\"o}ren, unterschieden sich hinsichtlich der Pr{\"a}valenz der Virulenzfaktormuster nicht vom Gesamtbild. Lediglich Isolate der ECOR-Gruppe B2 wiesen eine f{\"u}r sie typische H{\"a}ufung von Virulenzgenclustern auf. Das relativ geringe Vorkommen bzw. weitgehende Fehlen (5 von 8) von Adh{\"a}singenen spezifisch tierpathogener E. coli l{\"a}sst darauf schließen, dass bislang beschriebenen Rinder-pathogenen E. coli keine Bedeutung als Verursacher einer Rindermastitis zukommt. F{\"u}r die Analyse der chronischen Verlaufsform der Mastitis standen nur 21 Isolate zur Verf{\"u}gung, die keinen hinreichend gesicherten Vergleich zu den F{\"a}llen mit akuter klinischer Mastitis (199 St{\"a}mme insgesamt) erlauben. Die auff{\"a}llige Zunahme des H{\"a}molysingens hlyA (23,8 \%) gegen{\"u}ber 9,5 \% in den klinischen Isolaten (und 10,8 \% in allen St{\"a}mmen) m{\"u}sste in k{\"u}nftigen Untersuchungen invasiven Verhaltens der ExPEC beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass eine bovine Mastitis durch verschiedene E. coli-Varianten hervorgerufen werden kann und ein großes Potential extraintestinaler Virulenzfaktoren dazu nicht erforderlich ist. Entscheidend ist eine durch das fimH-Gen vermittelte Adh{\"a}sion, in der H{\"a}lfte der untersuchten F{\"a}lle unterst{\"u}tzt durch das Serumresistenz vermittelnde Gen traT.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Piechaczek2001,
  author    = {Piechaczek, Katharine},
  title     = {Untersuchungen zum Einfluß der Pathogenit{\"a}tsinseln I536 und II536 auf die Genexpression des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1862},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Escherichia coli wird als der h{\"a}ufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit ausl{\"o}sen zu k{\"o}nnen, ben{\"o}tigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen St{\"a}mmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-H{\"a}molysin, die Adh{\"a}sine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Auspr{\"a}gung der Virulenz h{\"a}ngt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenit{\"a}tsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 f{\"u}hrt zum Verlust der Virulenz und zur Zerst{\"o}rung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilit{\"a}t und die Enterobaktin- und a-H{\"a}molysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenit{\"a}tsinseln I536 und II536 f{\"u}r die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zun{\"a}chst eine Proteomanalyse durchgef{\"u}hrt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von pr{\"a}parativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kultur{\"u}berstandsfraktionen der untersuchten St{\"a}mme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen St{\"a}mme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgef{\"u}hrt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten St{\"a}mmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abh{\"a}ngiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in {\"a}hnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenit{\"a}t wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren {\"u}berpr{\"u}ft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgef{\"u}hrt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Oswald2006,
  author    = {Oswald, Sibylle},
  title     = {Molekularbiologische Untersuchungen des probiotischen Escherichia coli Stammes DSM 6601 und Entwicklung der stammeigenen Plasmide als Klonierungsvektoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23935},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) kann als Modellorganismus f{\"u}r die Verwendung eines kommensalen Gram-negativen Bakterienstammes als Probiotikum angesehen werden. Dieser E. coli Stamm wurde intensiv erforscht und seine Eigenschaften sind daher gut charakterisiert. Der probiotische Charakter dieses Bakterienstammes ist auf gute Kolonisierungseigenschaften des menschlichen Darms, immunmodulatorische Effekte und antagonistische Wirkungen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Der E. coli Stamm DSM 6601 wird seit einigen Jahrzehnten zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt und seine therapeutische Wirksamkeit ist wissenschaftlich bewiesen. Daher eignet sich dieser Stamm als Modellstamm f{\"u}r die Entwicklung eines bakteriellen Lebendvektors, der f{\"u}r mukosale Immunisierungen oder die zielgerichtete Lieferung von therapeutischen Molek{\"u}len in den Darm eingesetzt werden k{\"o}nnte. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der kryptischen Plasmide pMUT1 und pMUT2 des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 durch Analyse der DNA-Sequenz. Die Analyse ergab, dass das Plasmid pMUT1 ein Replikationssystem vom ColE1-Typ, ein Mobilisierungssystem sowie eine Stabilit{\"a}tsregion enth{\"a}lt, w{\"a}hrend das Plasmid pMUT2 ein ColE2-{\"a}hnliches Replikationssystem und ein anderes Mobilisierungssystem besitzt. In beiden Plasmiden konnten keine weiteren offenen Leserahmen mit bekannter Funktion identifiziert werden. Des Weiteren wurde ein spezifisches PCR-Nachweissystem f{\"u}r den E. coli Stamm DSM 6601 etabliert, das auf einer Methode zur direkten DNA-Isolierung aus Stuhlproben und einem optimierten PCR-Protokoll f{\"u}r auf den kryptischen Plasmiden basierende Primerkombinationen beruht. Dadurch konnte eine Sensitivit{\"a}t von 10(3)-10(4) Bakterien/0,1 g Stuhl erreicht werden, die vergleichbar mit den Nachweisgrenzen anderer beschriebener PCR-Nachweissysteme ist. Durch Analysen von Patientenstuhlproben wurde die Spezifit{\"a}t und der diagnostische Nutzen dieses PCR-Nachweissystems best{\"a}tigt. Dar{\"u}ber hinaus wurde eine plasmidfreie Variante des E. coli Stammes DSM 6601 hergestellt. Durch funktionelle Untersuchungen dieses Stammes konnten keine Unterschiede im Vergleich zu dem Wildtyp festgestellt werden, wodurch eine m{\"o}gliche Funktion der beiden kryptischen Plasmide weiterhin unklar bleibt. Diese plasmidfreie Variante kann als Lebendvektor f{\"u}r rekombinante Plasmide auf Basis der Plasmide pMUT1 und pMUT2 verwendet werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren f{\"u}r den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601. Durch Integration von Antibiotika-Resistenzkassetten in die Plasmide pMUT1 und pMUT2 wurden Klonierungsvektoren konstruiert, die auch nach Insertion weiterer DNA-Fragmente ohne Antibiotika-Selektionsdruck stabil in diesem Stamm beibehalten werden. Zus{\"a}tzlich wurde durch die stabile Expression von fluoreszierenden Proteinen ein visuelles Nachweissystem etabliert, das bei in vivo Experimenten verwendet werden kann. Dadurch wird die M{\"o}glichkeit geboten, Erkenntnisse {\"u}ber Kolonisierungseigenschaften sowie Interaktionen des E. coli Stammes DSM 6601 mit endogenen Mikroorganismen und Zellen des Darmimmunsystems zu erlangen, was zur Aufkl{\"a}rung der Wirkungsweise dieses Stammes beitragen k{\"o}nnte. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Lebendvakzins auf der Basis des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 wurden Adh{\"a}sine von humanpathogenen enteroh{\"a}morrhagischen E. coli und von tierpathogenen enterotoxischen E. coli in diesem Stamm exprimiert. Bei ersten Immunisierungsversuchen in M{\"a}usen konnte jedoch keine Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen diese Adh{\"a}sine nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des E. coli Stammes DSM 6601 auf die Invasivit{\"a}t von Salmonellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ 1- und F1C-Fimbrien keine Rolle bei dem inhibitorischen Effekt in vitro spielen und dass durch diesen E. coli Stamm in konventionellen M{\"a}usen keine inhibitorischen Wirkungen nachzuweisen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden durch die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren und die Etablierung von Nachweissystemen f{\"u}r den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601 die Grundlage f{\"u}r den Einsatz dieses Stammes als Lebendvektor und f{\"u}r in vivo Untersuchungen, die zur Aufkl{\"a}rung der Wirkungsmechanismen dieses Stammes beitragen k{\"o}nnten.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mordhorst2009,
  author    = {Mordhorst, Ines Louise},
  title     = {Phylogenetische und funktionelle Analysen zur Kapsel O-Acetyltransferase NeuO von Escherichia coli K1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47880},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-St{\"a}mme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier avi{\"a}re Coliseptik{\"a}mien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus \&\#945;-2,8-verkn{\"u}pften Sialins{\"a}uremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem f{\"u}r die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung f{\"u}r das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteri{\"a}mie) und aus an Coliseptik{\"a}mie erkrankten V{\"o}geln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie f{\"u}nf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand h{\"a}ufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 St{\"a}mme (44\%) angeh{\"o}rten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-St{\"a}mme waren neuO-positiv (56\%). Das Gen wurde in 78 (98\%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24\%) der 103 nicht-STC95-St{\"a}mme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. {\"U}ber Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und avi{\"a}re E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser St{\"a}mme unterst{\"u}tzt. In den in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die F{\"a}higkeit der Bakterien an humane mikrovaskul{\"a}re Gehirnendothelzellen zu adh{\"a}rieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im H{\"u}hnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des H{\"u}hner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erh{\"o}hte. M{\"o}glicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Middendorf2005,
  author    = {Middendorf, Barbara},
  title     = {Untersuchungen zur Instabilit{\"a}t von Pathogenit{\"a}tsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 : "Island Probing" von PAI I(536) - PAI V(536)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16573},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Der uropathogene Escherichia coli Stamm 536 (O6:K15:H31) stammt aus einem Patienten mit akuter Pyelonephritis und ist heute einer der Hauptmodellorganismen f{\"u}r Studien zum Vorkommen und zur Funktionalit{\"a}t von Pathogenit{\"a}tsinseln (PAIs). Sein Genom enth{\"a}lt sechs genetische Elemente (PAI I(536) bis PAI VI(536)), die an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms integriert sind und die Hauptkriterien f{\"u}r PAIs erf{\"u}llen. Sie kodieren f{\"u}r viele Virulenzfaktoren des Stammes, sind am 3' Ende von tRNA Genen integriert, enthalten teils kryptische Fragmente mobiler genetischer Elemente wie Integrase- oder Transposasegene und werden meist von IS Elementen oder 'direct repeats' (DRs) flankiert. Dar{\"u}ber hinaus haben sie die Tendenz, instabil zu sein und aus dem Chromosom zu deletieren. Mit Ausnahme von PAI IV(536) sind alle PAIs von E. coli 536 mit intakten Integrasegenen assoziiert, die zu int Genen des Coliphagen P4 bzw. des Shigella flexneri Phagen SfX {\"a}hnlich sind. Neuere Untersuchungen zeigen, daß diese Gene exprimiert werden und f{\"u}r funktionelle Enzyme kodieren. Zus{\"a}tzlich werden die PAIs ebenfalls mit Ausnahme von PAI IV(536) von DRs unterschiedlicher Gr{\"o}ße flankiert, die den Randbereichen von Prophagen im prokaryontischen Chromosom entsprechen. Es ist daher wahrscheinlich, daß PAI-Deletionen vergleichbar zum Insertions-/Exzisionsmechanismus von Bakteriophagen durch die jeweilige PAI-assoziierte Integrase vermittelt werden und durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs erfolgen. Die Instabilit{\"a}t von PAI I(536) und PAI II(536) ist schon fr{\"u}h belegt worden. Jede Insel kodiert f{\"u}r eine H{\"a}molysindeterminante und ihre Kodeletion f{\"u}hrt zu einem ah{\"a}molytischen Ph{\"a}notyp, der mit einer H{\"a}ufigkeit von 3×10(-5) in vivo und bis 1x10(-3) in vitro auftritt. Die Exzision erfolgt durch ortsspezifische Rekombination zwischen den 16 bp bzw. 18 bp großen flankierenden DRs der PAIs. Da den {\"u}brigen E. coli 536-spezifischen PAIs entsprechende ph{\"a}notypische Marker fehlen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit das 'Island Probing'-Verfahren angewendet, um die Instabilit{\"a}t von PAI I(536) bis PAI V(536) im Detail zu untersuchen. Dazu wurde der negative Selektionsmarker sacB separat in die PAIs integriert. Zellen, die diesen Marker tragen, sind saccharosesensitiv und k{\"o}nnen nur in Gegenwart hoher Saccharosekonzentrationen wachsen, nachdem die sacB-markierte PAI aus dem Chromosom deletiert wurde. Auf diese Weise konnten von sacB-markierten Derivaten des Stammes E. coli 536 gezielt PAI-negative Zellen isoliert werden, um die Grunddeletionsraten der PAIs zu bestimmen und ihre Randbereiche zu analysieren. Zus{\"a}tzlich wurde der Einfluß verschiedener Umwelteinfl{\"u}sse wie niedrige/hohe Temperatur, osmotischer Streß, N{\"a}hrstoffmangel, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Gegenwart konjugativer Plasmide auf die Exzisionsrate untersucht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, daß PAIs von E. coli 536 mit unterschiedlicher H{\"a}ufigkeit deletieren. W{\"a}hrend PAI II(536) und PAI III(536) mit Deletionsraten von 2×10(-5) bzw. 5x10(-5) am instabilsten sind, liegen die Exzisionsraten von PAI I(536) und PAI V(536) mit 2x10(-6) bzw. 1×10(-6) niedriger und deuten auf eine fortschreitende Stabilisierung dieser PAIs hin. Im Gegensatz dazu ist PAI IV(536) bereits vollst{\"a}ndig stabil in das Chromosom eingebettet. W{\"a}hrend die Exzision von PAI I(536), PAI II(536) und PAI V(536) RecA-unabh{\"a}ngig ist und auf ortsspezifischer Rekombination zwischen ihren flankierenden DRs beruht, treten bei PAI III(536) zwei alternative Deletionsmechanismen auf. Die Exzision dieser PAI erfolgt entweder vollst{\"a}ndig durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs oder partiell durch homologe Rekombination zwischen zwei IS100 Elementen innerhalb der PAI. Unabh{\"a}ngig vom Rekombinationsmechanismus f{\"u}hrt die Deletion aber in allen F{\"a}llen zur Bildung zirkul{\"a}rer Intermediate (CIs), die vermutlich aufgrund fehlender Replikationsstartpunkte bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengehen. Obwohl CIs von PAI II(536) und PAI III(536) mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen identifiziert werden konnten, war ein PCR-Nachweis PAI I(536)- und PAI V(536)-spezifischer CIs bedingt durch die niedrigen Deletionsraten dieser Inseln nicht m{\"o}glich. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, daß die Deletion von PAI II(536) und PAI III(536) bei niedriger Wachstumstemperatur, hoher Zelldichte und N{\"a}hrstoffmangel in vitro induzierbar ist, d. h. unter Bedingungen, die auch in nat{\"u}rlichen Biofilmen auftreten k{\"o}nnen. Andere Bedingungen wie osmotischer Streß, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Anwesenheit konjugativer Plasmide haben keinen Einfluß auf die Deletionsrate der PAIs. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Instabilit{\"a}t von PAIs bei E. coli 536 in vivo eine wichtige Rolle spielt indem sie zur Genomflexibilit{\"a}t und Evolution sowie zur Modulation der Virulenzgenexpression der Bakterien beitr{\"a}gt.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Michaelis2005,
  author    = {Michaelis, Kai},
  title     = {Untersuchungen zur Genomstruktur und Biofilmbildung von pathogenen Escherichia coli Isolaten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17593},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und {\"u}ber das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen h{\"a}ufig Gene f{\"u}r Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate n{\"a}her untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden f{\"u}r Gene, die f{\"u}r die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zus{\"a}tzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen St{\"a}mmen mit Derivaten, bei denen Pathogenit{\"a}tsinseln deletiert sind, best{\"a}tigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenit{\"a}tsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten St{\"a}mme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die gr{\"o}ßten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms geh{\"o}ren und charakteristisch f{\"u}r das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch {\"A}nderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinfl{\"u}sse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abh{\"a}ngige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erh{\"o}hte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberfl{\"a}chenprotein als Hauptfaktor f{\"u}r die RfaH-abh{\"a}ngige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verk{\"u}rzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verst{\"a}rkte Biofilmbildung. Vermutlich verst{\"a}rkte die verbesserte Pr{\"a}sentation von Agn43 durch ein verk{\"u}rztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberfl{\"a}chenstrukturen, wie die Colans{\"a}ure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der St{\"a}mme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenit{\"a}tsinseln waren temperaturabh{\"a}ngig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch ph{\"a}notypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abh{\"a}ngig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der {\"a}ußeren Membran durch eine ver{\"a}nderte LPS-Struktur und die Expression von Adh{\"a}sinen die Biofilmbildung beeinflussen k{\"o}nnen.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}