@phdthesis{Loeschberger2014,
  author    = {L{\"o}schberger, Anna},
  title     = {Biologische Referenzstrukturen und Protokolloptimierung in der hochaufl{\"o}senden Fluoreszenzmikroskopie mit dSTORM},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-102630},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochaufl{\"o}senden Fluoreszenzmikroskopie. Sie erm{\"o}glicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herk{\"o}mmlichen Methoden h{\"o}here Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverl{\"a}ssigkeit erst noch {\"u}berzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Aufl{\"o}sungsverm{\"o}gen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filament{\"o}se Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht aufl{\"o}sbar ist, als Modellstruktur f{\"u}r die hochaufl{\"o}sende Fluoreszenzmikroskopie eingef{\"u}hrt. Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernh{\"u}llen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgel{\"o}st. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgel{\"o}st werden. Die Daten eigneten sich außerdem f{\"u}r eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln. Dar{\"u}ber hinaus wurden Zweifach-F{\"a}rbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ans{\"a}tze f{\"u}r Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardm{\"a}ßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral {\"u}berlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch f{\"u}r 3D-Messungen mit den Ans{\"a}tzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernh{\"u}lle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Kr{\"u}mmung des Zellkerns {\"u}ber die gef{\"a}rbten Kernporen dargestellt. dSTORM-Messungen k{\"o}nnen nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgef{\"u}hrt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erh{\"a}ltliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellul{\"a}rer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM m{\"o}glich sind. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernh{\"u}llen zuerst mit dSTORM hochaufgel{\"o}st und danach f{\"u}r die EM pr{\"a}pariert. Anschließend wurden zugeh{\"o}rige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine k{\"o}nnen somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Aufl{\"o}sung dargestellt werden. Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpr{\"a}paration voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Pr{\"a}misse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. W{\"a}hrend bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zellul{\"a}re Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerst{\"o}rt werden, sch{\"u}tzt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Pr{\"a}parationen werden unter Umst{\"a}nden erstmals in der Hochaufl{\"o}sung sichtbar. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine m{\"o}gliche DNA-Cross-Linking-F{\"a}higkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolek{\"u}linformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt {\"u}ber die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunf{\"a}hig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - l{\"a}sst sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinit{\"a}t zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht.},
  subject      = {Fluoreszenzmikroskopie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klein2014,
  author    = {Klein, Teresa},
  title     = {Lokalisationsmikroskopie f{\"u}r die Visualisierung zellul{\"a}rer Strukturen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99260},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Einf{\"u}hrung der Fluoreszenzmikroskopie erm{\"o}glicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Aufl{\"o}sung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierf{\"u}r photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz r{\"a}umlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu k{\"o}nnen. Aus tausenden Einzelmolek{\"u}l-Lokalisationen wird ein k{\"u}nstliches, hochaufgel{\"o}stes Bild rekonstruiert. Die hochaufl{\"o}sende Mikroskopie ist grade f{\"u}r die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzellul{\"a}re Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu k{\"o}nnen. Als Marker k{\"o}nnen sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. W{\"a}hrend die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der h{\"o}heren Photonenausbeute eine pr{\"a}zisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren {\"u}ber sogenannte chemische Tags erm{\"o}glicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gef{\"a}rbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich f{\"u}r die Hochaufl{\"o}sung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden k{\"o}nnen. F{\"u}r besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings k{\"o}nnen unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfl{\"a}che mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photosch{\"a}digung m{\"o}glichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die M{\"o}glichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu k{\"o}nnen, stellt einen großen Gewinn f{\"u}r die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der urspr{\"u}nglich farbstoffgekoppelte Antik{\"o}rper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgekl{\"a}rt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellul{\"a}r vorhandene Peptide gr{\"o}ßere Aggregate formen als die im extrazellul{\"a}ren Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen.},
  subject      = {Hochaufl{\"o}sendes Verfahren},
  language  = {de}
}