@phdthesis{Dankworth2013, author = {Dankworth, Beatrice}, title = {Charakterisierung der dynamischen Interaktion des Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptors mit den Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6)-Kan{\"a}len und Generierung von β-Zell-spezifischen GC-A-knock-out-M{\"a}usen sowie die Analyse der Bedeutung von ANP f{\"u}r die Insulin-Hom{\"o}ostase unter pathophysiologischen Bedingungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78650}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellul{\"a}ren Produktion von cGMP {\"u}ber den membranst{\"a}ndigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkan{\"a}len Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst k{\"u}rzlich konnte gezeigt werden, dass ANP {\"u}ber GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabh{\"a}ngige Weise stimuliert. Um eine m{\"o}gliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpr{\"a}zipitation mit einem anti-Flag-Antik{\"o}rper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabh{\"a}ngig von ANP mit GC-A ko-immunpr{\"a}zipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Dom{\"a}ne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer {\"U}berproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antik{\"o}rper die Koimmunpr{\"a}zipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgef{\"u}hrt, um die lokale N{\"a}he von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine m{\"o}gliche ANP-induzierte Konformations{\"a}nderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen f{\"u}hrte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabh{\"a}ngig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP f{\"u}hrte dagegen zu keiner Ver{\"a}nderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse best{\"a}tigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der f{\"u}r den neuen cGMP-unabh{\"a}ngigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A f{\"u}r die Insulinaussch{\"u}ttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans'schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP f{\"u}r die systemische Glukose-Hom{\"o}ostase zu ergr{\"u}nden, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans'schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht m{\"o}glich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressions{\"a}nderung von GC-A in anderen Geweben f{\"u}hrte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO M{\"a}use blieb unauff{\"a}llig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP f{\"u}r die Insulinaussch{\"u}ttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere f{\"u}r 12 Wochen einer fettreichen Ern{\"a}hrung (60\% Fett) ausgesetzt um einen Pr{\"a}diabetes auszul{\"o}sen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgef{\"u}hrt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der N{\"u}chternglukosewert in den weiblichen KO-M{\"a}usen leicht erh{\"o}ht ist. Daher wurden die oGTT's in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle M{\"a}use eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60\% erh{\"o}ht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und f{\"u}r immunhistologische Zwecke pr{\"a}pariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergr{\"o}ßerte durchschnittliche Inselfl{\"a}che und eine erh{\"o}hte durchschnittliche β-Zellfl{\"a}che der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen f{\"u}hrt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Pr{\"a}diabetes beitr{\"a}gt. Eine m{\"o}gliche verst{\"a}rkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell k{\"o}nnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems f{\"u}r die Insulinaussch{\"u}ttung n{\"a}her ergr{\"u}nden und dadurch eventuell neue Therapieans{\"a}tze f{\"u}r Diabetes mellitus Typ 2 bringen.}, subject = {Atriales natriuretisches Hormon}, language = {de} }