@phdthesis{Kemmer2001,
  author    = {Kemmer, Gabriele},
  title     = {Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien f{\"u}r H{\"a}min unter aeroben Bedingungen und f{\"u}r Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es k{\"o}nnen zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten St{\"a}mme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren St{\"a}mme, die f{\"u}r Oberfl{\"a}cheninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig {\"u}ber die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des H{\"a}minaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der H{\"a}min-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) f{\"u}r die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht f{\"a}hig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, w{\"a}hrend die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu kl{\"a}ren, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig f{\"u}r die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivit{\"a}t. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivit{\"a}t die einzige f{\"u}r die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminos{\"a}ureaustausch die Phosphatase-Aktivit{\"a}t verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Ph{\"a}notypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die F{\"a}higkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Ph{\"a}notypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die f{\"a}hig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivit{\"a}t nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN f{\"u}r die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht f{\"a}hig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschr{\"a}nkt, w{\"a}hrend mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR {\"u}ber einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der {\"a}ußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren.},
  subject      = {Haemophilus influenzae},
  language  = {de}
}