@phdthesis{Jaborsky2013, author = {Jaborsky, Mario}, title = {Extraflorale Nektarien der Pappeln Populus trichocarpa und Populus tremula x P. tremuloides : Unterschiede und Gemeinsamkeiten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85240}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurden extraflorale Nektarien (EFN) von Populus trichocarpa (Ptr) und Populus tremula x Populus tremuloides (Ptt) hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften bei der indirekten Herbivoren-Abwehr untersucht. Die gewonnenen Erkenntnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Nektarien-Funktion und -Regulation: Beide untersuchten EFN-Arten sind in der Lage, die jeweilige Pappel indirekt vor Sch{\"a}digung durch Herbivoren zu sch{\"u}tzen. Dies zeigte nicht zuletzt der jeweils beobachtete kontinuierliche Besuch verschiedenster Insektenarten. Vor allem Ameisen aber auch Bienen z{\"a}hlten zu Besuchern sowohl von Ptr als auch Ptt. Die Effektivit{\"a}t so angelockter Besucher konnte durch Interaktionsversuche mit Bienen best{\"a}tigt werden und belegte, dass allein die Anwesenheit von Bienen zu einer eindeutigen Reduktion des herbivoren Blattschadens f{\"u}hrt (Ptr und Ptt). Obwohl beide Pflanzen derselben Gattung (Populus) angeh{\"o}ren, konnte best{\"a}tigt werden, dass Ptr und Ptt unterschiedliche Herbivoren-Abwehrstrategien entwickelt haben. W{\"a}hrend es sich bei Ptt-EFN um konstitutiv vorhandene Organe handelt, zeigten Ptr-Pflanzen eine gezielte Bildung von Nektarien/Nektar erst nach Herbivorenbefall. Dabei scheinen spezifische, durch Herbivoren erzeugte Signale f{\"u}r die Induktion verantwortlich zu sein. Die Freisetzung der nach Herbivorenbefall typischen, fl{\"u}chtigen organischen Verbindungen (VOCs) in Ptr konnte zwar als Jasmons{\"a}ure-abh{\"a}ngig identifiziert, der Jasmons{\"a}ure-Signalweg, der schon als Ausl{\"o}ser f{\"u}r extraflorale Nektar-Produktion bei z.B. Limabohne gezeigt worden war, als alleiniges Steuerelement aber ausgeschlossen werden. Ein Zusammenspiel mehrerer Hormone bei der Regulation der indirekten Herbivoren-Abwehr in Ptr durch Nektarien/Nektar-Induktion ist deshalb sehr wahrscheinlich. Dies bekr{\"a}ftigten auch die Transkriptomanalysen von Ptt-Nektarien. Hier konnte gezeigt werden, dass sowohl Jasmons{\"a}ure als auch Auxin und Salicyls{\"a}ure eine wichtige Rolle spielen. Dar{\"u}ber hinaus lieferten verschiedene differentiell regulierte Gencluster, die in Zusammenhang mit Nektarien-Funktion, -Entwicklung und biotischem Stress stehen, deutliche Hinweise auf die entscheidende Rolle extrafloraler Nektarien bei der Herbivoren-Abwehr. Nektar-Produktion: Die Analyse extrafloraler Nektar-Proteine und zugeh{\"o}riger Transkripte zeigte nicht nur, dass beide Pappelarten {\"u}ber eine {\"a}hnliche, von antimikrobiellen Proteinen dominierte Nektar-Proteinzusammensetzung verf{\"u}gen, sondern auch, dass bei beiden die Produktion dieser Proteine haupts{\"a}chlich direkt in den Dr{\"u}senorganen stattfindet. Es deutete außerdem alles darauf hin, dass der Zucker des Ptt-Nektars direkt im Nektarienparenchym produziert wird, und dass daf{\"u}r ein apoplastischer Schritt notwendig ist, der gleichzeitig {\"u}ber das „Source und Sink" Verh{\"a}ltnis den Nachschub von Saccharose ins Nektarienparenchym reguliert. Nektar-Sekretion: Die unterschiedlichen Hauptsekretionsarten der beiden Pappeln konnten ebenfalls gezeigt werden. W{\"a}hrend Ptt-Nektar eindeutig granulokrin sekretiert wird, konnte dieser Weg f{\"u}r Ptr ausgeschlossen werden. Deshalb scheint Ptr holokrine Sekretion zu bevorzugen. In Ptt fanden sich außerdem Belege f{\"u}r eine parallel ablaufende ekkrine Sekretion. Hierf{\"u}r wird die initiale Abgabe osmotisch wirksamer Substanzen und nachfolgend Wasser vorausgesetzt. Der Anionenkanal PttSLAH3 zeigte sich, ausgehend von der Anionenzusammensetzung des Nektars und der Lokalisation des Proteins in den epidermalen Dr{\"u}senzellen als optimales Transportprotein f{\"u}r diesen Schritt. Die typischen Eigenschaften eines S-Typ-Anionenkanals vom Typ des Arabidopsis-SLAH3, wie Nitratabh{\"a}ngigkeit und spezifische Anionenpermeabilit{\"a}t wiesen darauf hin, dass PttSLAH3 f{\"u}r die finale „nasse" Sekretion verantwortlich sein kann. Im Unterschied zu AtSLAH3 scheint die Aktivierung von PttSLAH3 allerdings auf andere Weise zu erfolgen. Denn im Gegensatz zum Arabidopsis-Ortholog, zeigte PttSLAH3 in Xenopus-Oozyten bereits ohne koexprimierte Kinase Aktivit{\"a}t. Grunds{\"a}tzlich konnte eine Aktivierung durch Phosphorylierung aber nicht ausgeschlossen werden. Es deutete vielmehr alles darauf hin, dass bereits Oozyten-endogene Kinasen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von PttSLAH3 spielen. Eine entsprechende Phosphorylierungsstelle konnte jedoch nicht ausgemacht werden. Allerdings deuteten die Ergebnisse im Weiteren darauf hin, dass die unterschiedliche Struktur der AtSLAH3- und PttSLAH3-Termini, im Besonderen die des N-Terminus, f{\"u}r die konstitutive Aktivit{\"a}t des Pappel-Kanals verantwortlich ist. Damit kommt PttSLAH3 eine Sonderstellung innerhalb der SLAC/SLAH-Familie zu, die weiterer Untersuchungen bedarf.}, subject = {Pappel}, language = {de} } @phdthesis{Larisch2011, author = {Larisch, Christina}, title = {Laser Mikrodissektion als Tool f{\"u}r gewebespezifische Expressionsanalysen in Pflanzen: Methodik und Anwendung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70182}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool f{\"u}r Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 \% reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualit{\"a}t und Quantit{\"a}t der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene f{\"u}hrt, verzichtet und eine deutlich gr{\"o}ßere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 \% der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Bl{\"u}tenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Ausl{\"o}sung der SAR f{\"u}hren, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Bl{\"u}tenstiele v. a. der Jasmons{\"a}ureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorg{\"a}nge im Phloem deutlich besser aufgel{\"o}st werden k{\"o}nnen, da die Untersuchungen an kompletten Bl{\"u}tenstielen deutliche Abweichungen gegen{\"u}ber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugeh{\"o}rigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. {\"U}ber auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es m{\"o}glich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalit{\"a}t der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Fr{\"u}hjahr.}, subject = {Pappel}, language = {de} } @phdthesis{Langer2003, author = {Langer, Katharina}, title = {K+-Hom{\"o}ostase und kaliumabh{\"a}ngige Xylogenese in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7068}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Mit molekularbiologischen und biophysikalischen Analysen sowie immunologischen Nachweisen wurden Grundlagen des kaliumabh{\"a}ngigen Holzwachstums erforscht. Aus Holz-Kambium-Bast-Gewebe wurden mit PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) und PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake transporter 1) drei Volll{\"a}ngen putativer Kaliumtransporter isoliert. PTK2 ließ sich anhand der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenz der AKT2/3-Unterfamilie und KPT1 dem KAT1-Subtyp der Shaker-Familie zuordnen, w{\"a}hrend sich PtKUP1 in die Familie der KT/KUP/HAK-Transporter einreihte. Ein direkter Zusammenhang zwischen Kaliumtransport und holzbildenden Zellen konnte durch Verringerung der Gef{\"a}ßweiten und signifikante Schrumpfung der Streckungszone nach lokal begrenzter Applikation des Kaliumkanalblockers TEA+ sowie durch Kaliumlimitierende Bedingungen hergestellt werden. Die Transkripte von PTK2 und PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel) wurden in den Leitgeweben des Stammes, dort besonders im Phloem und in Schließzellen lokalisiert. KPT1 wurde fast ausschließlich in den Schließzellen nachgewiesen. Die mRNA von PtKUP1 war ubiquit{\"a}r in geringen Mengen vorhanden. Funktionell wurde PTK2 als schwach spannungsabh{\"a}ngiger, K+-selektiver, nicht-gleichrichtender Kaliumkanal charakterisiert. Wie AKT2/3-{\"a}hnliche Kaliumkan{\"a}le, wurde PTK2 durch Protonen und spannungsabh{\"a}ngig durch Calcium geblockt. KPT1 und PtKUP1 komplementierten einen Bakterienstamm in seiner Kalium-Aufnahmedefizienz und repr{\"a}sentieren demnach Kalium-Aufnahmesysteme. In Protoplasten einer Pappel-Suspensionskultur konnte ein ausw{\"a}rtsgleichrichtender, kalium- und spannungsabh{\"a}ngiger, K+-Kanal nachgewiesen werden. Dieser Ausw{\"a}rtsgleichrichter zeigte langsame, sigmoidale Aktivierungskinetiken, {\"a}hnlich den Kaliumstr{\"o}men PTORK-exprimierender Oocyten. Des Weiteren wurde in der Suspensionskultur ein einw{\"a}rtsgleichrichtender, spannungsabh{\"a}ngiger K+-selektiver Kanal detektiert, der, wie PTK2 in Xenopus-Oocyten, spannungsabh{\"a}ngig durch Calcium geblockt wurde. Nach Zugabe extrazellul{\"a}ren C{\"a}siums kam der Einw{\"a}rtsstrom vollst{\"a}ndig zum Erliegen. F{\"u}r alle drei Kaliumkan{\"a}le der Pappel sowie den Kalium-Carrier wurden die Promotorregionen isoliert. Sie enthielten Motive f{\"u}r licht- und temperaturabh{\"a}ngige Transkription, gewebespezifische Expression im Leitgewebe, in Schließzellen und in Wurzeln, sowie hormonabh{\"a}ngige Transkription. Die Genaktivit{\"a}ten von PTORK und PTK2 wurden nach Transformation von A. thaliana mit geeigneten Promotor-GUS-Konstrukten im Phloem und Xylemparenchym von Blattstielen nachgewiesen. Erstmals f{\"u}r Pflanzen wurden mit PTORK und PTK2 Kaliumkanal-Proteine immunologisch durch Antik{\"o}rper in Phloem- und Strahlzellen w{\"a}hrend des aktiven Holzwachstums lokalisiert. W{\"a}hrend PTK2 gleichm{\"a}ßig in den Strahlzellen verteilt war, wurde im gleichen Zelltyp f{\"u}r PTORK eine polare Anordnung zu den angrenzenden Gef{\"a}ßen hin beobachtet. Um die verschiedenen Kaliumtransporter mit der kambialen Aktivit{\"a}t und dem Holzwachstum zu verkn{\"u}pfen, wurden die Expressionsprofile mit jahreszeitlichen {\"A}nderungen der Kaliumgehalte im Stamm verglichen. Die Transkriptanalyse von PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 {\"u}ber den Zeitraum eines Jahres in Stamm- und Blattknospen zeigte eine transkriptionelle Korrelation von PTORK und PTK2 mit der saisonal begrenzten Holzbildung. Ihre hohen Transkriptmengen im Herbst lassen, zusammen mit ihrer Lokalisation im Leitgewebe und ihren funktionellen Eigenschaften, auf eine Beteiligung der beiden Kaliumkan{\"a}le an Speicherungsvorg{\"a}ngen in die lebenden Mark- und Baststrahlen im Herbst schließen. Im Fr{\"u}hjahr dagegen, wenn sich die Kaliumstr{\"o}me umkehren, um „sink"-Gewebe mit Kalium zu versorgen, wird das Kalium vermutlich haupts{\"a}chlich {\"u}ber PTK2, der dann maximal exprimiert wird, aus den Strahlen und Gef{\"a}ßen zu den Meristemen in Stamm und Knospen transportiert. Die haupts{\"a}chlich in Schließzellen lokalisiert KPT1 wurde zur Knospen{\"o}ffnung transient induziert. Damit k{\"o}nnte gesichert werden, dass ausreichend osmotisch aktives Kalium f{\"u}r Zellexpansion und Stoma{\"o}ffnung in die Schließzellen gelangt. PtKUP1 war in allen Geweben w{\"a}hrend des gesamten Jahres niedrig exprimiert und sichert daher vermutlich eine Kaliumversorgung auch unter limitierenden Bedingungen. Zur Vermehrung und Schaffung neuen Pflanzenmaterials wurde eine sterile Agarkultur aus P. tremula x P. tremuloides sowie eine Pappel-Suspensionskultur aus oberirdischem, sich teilendem Sprossgewebe etabliert. Die Expressionsanalyse der Zellkultur deutete auf eine Ausstattung an Kaliumkan{\"a}len wie in Wurzelhaaren hin, mit hohen Transkriptzahlen f{\"u}r PTORK, geringer Expression von PTK2 und geringsten PtKUP1-Transkripten.}, subject = {Pappel}, language = {de} }