@phdthesis{Bothe2021,
  author    = {Bothe, Sebastian Helmut},
  title     = {Fragmentbasiertes Design von p97-Liganden: Identifizierung von Startstrukturen zur Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren f{\"u}r die SHP-Bindestelle der AAA+ ATPase p97},
  doi       = {10.25972/OPUS-23911},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-239112},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellul{\"a}rer Prozesse beteiligt ist und eine Schl{\"u}sselrolle in der Protein-Hom{\"o}ostase spielt. Die funktionale Diversit{\"a}t von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Dom{\"a}ne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur f{\"u}r die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein k{\"o}nnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Dom{\"a}ne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor w{\"a}re nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern h{\"a}tte auch einen besonderen Nutzen f{\"u}r die Entschl{\"u}sselung molekularer und zellul{\"a}rer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz f{\"u}r die Identifizierung von chemischen Startstrukturen f{\"u}r die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Dom{\"a}ne gew{\"a}hlt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergest{\"u}tzte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, R{\"o}ntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Dar{\"u}ber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgef{\"u}hrten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen f{\"u}r die experimentelle Validierung ausgew{\"a}hlt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden best{\"a}tigt werden. In einem parallel durchgef{\"u}hrten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Dom{\"a}ne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay best{\"a}tigt. F{\"u}nf dieser Verbindungen zeigten Affinit{\"a}ten mit KD-Werten kleiner 500μMund g{\"u}nstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinit{\"a}t des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Dom{\"a}ne best{\"a}tigt werden. Zur Identifizierung m{\"o}glicher Bindestellen dieser f{\"u}nf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgef{\"u}hrt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Dom{\"a}ne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit m{\"o}gliche Ankerpunkte f{\"u}r die Weiterentwicklung dar. F{\"u}r zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels R{\"o}ntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten best{\"a}tigt werden. Die erhaltene R{\"o}ntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Dom{\"a}ne zeigt.},
  subject      = {Arzneimitteldesign},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Teutschbein2008,
  author    = {Teutschbein, Janka},
  title     = {Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Proteinen in der Xmrk-induzierten Entwicklung von Melanomen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27516},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Melanome stellen die gef{\"a}hrlichste Form von Hautkrebs mit der h{\"o}chsten Mortalit{\"a}tsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Ver{\"a}nderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Ausl{\"o}ser der Melanominitiation und -progression. Die Aufkl{\"a}rung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verst{\"a}ndnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am st{\"a}rksten herabregulierten Genen geh{\"o}rten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die f{\"u}r die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei f{\"u}r die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abh{\"a}ngigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Dar{\"u}ber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zuk{\"u}nftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufkl{\"a}rung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ung{\"u}nstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht m{\"o}glich, den Rezeptor als K{\"o}derprotein einzusetzen. Das f{\"u}r die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als K{\"o}der etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK f{\"u}r die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gew{\"a}hrleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie k{\"o}nnte Einblicke in weitere FYN-abh{\"a}ngige Ereignisse bieten, die zur Aufkl{\"a}rung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen k{\"o}nnte.},
  subject      = {Melanom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Cordes2007,
  author    = {Cordes, Tatjana},
  title     = {Bindungsverhalten der verschiedenen NFAT-Transkriptionsfaktoren an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsf{\"a}higkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77-Promotors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25964},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Sowohl NFAT- (Nukle{\"a}re Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- ('myosin-enhancer factor 2') Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und k{\"o}nnen dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Ver{\"o}ffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsf{\"a}higkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterst{\"u}tzt, ist jedoch nicht wesentlich beeintr{\"a}chtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden k{\"o}nnen. Dagegen f{\"u}hrt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden k{\"o}nnen. In ihrer F{\"a}higkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/\&\#945;A, NFATc1/\&\#945;C oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine m{\"o}gliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist.},
  subject      = {Transkriptionsfaktor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kerl2004,
  author    = {Kerl, Hans Ulrich},
  title     = {Charakterisierung interagierender Proteine des renalen ATP-abh{\"a}ngigen Kaliumkanals ROMK},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13506},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {ROMK ist ein einw{\"a}rts-gleichrichtender Kaliumkanal, der haupts{\"a}chlich in der Niere exprimiert wird. Er wird dabei vor allem in der apikalen Membran des aufsteigenden Astes der Henleschen Schleife, dem distalen Tubulus und dem Sammelrohr exprimiert. Die Hauptaufgaben von ROMK bestehen in der Rezirkulation von Kalium im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife und der Kaliumsekretion im kortikalen Sammelrohr. ROMK wurde kloniert und in Oozyten exprimiert. Die Expression sowie Struktur- und Funktionsstudien haben viele Informationen {\"u}ber die Biophysik und die Regulation dieses Kanals gebracht. Dennoch ist bisher wenig {\"u}ber die f{\"u}r den Transport zur apikalen Membran von Epithelzellen verantwortlichen Mechanismen des Kanals bekannt. Der C- Terminus von ROMK ist aufgrund einer sehr hohen Homologie zu einem PDZ-Motiv ein m{\"o}glicher Teilnehmer an Protein- Protein Interaktionen. In einem Hefe-zwei-Hybrid Screen wurden verschiedene m{\"o}gliche Interaktionspartner gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen einigen im Hefe-System gefundenen Proteinen und dem Kanalprotein zu identifizieren, verifizieren und charakterisieren. In dem in vitro HIS- Pulldown Assay konnten die im Hefe-zwei-Hybrid System gefundenen Interaktionen zwischen ROMK und HEF1, Antiquitin1 sowie Calponin2 best{\"a}tigt werden. Ebenso war es m{\"o}glich, durch Kolokalisationsstudien mittels indirekter Immunfluoreszenz weitere Anhaltspunkte f{\"u}r eine m{\"o}gliche Interaktion von ROMK und Antiquitin1, Calponin2, Shank und ArgBP2 zu liefern. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die gefundenen Interaktionspartner zum einen f{\"u}r den Einbau und die Stabilit{\"a}t von ROMK in der Membran zust{\"a}ndig sein und zum anderen durch Verbindung zu m{\"o}glichen Signalkomplexen, z.B. durch ArgBP2, ein Rolle in der Aktivit{\"a}tssteuerung von ROMK spielen k{\"o}nnten.},
  language  = {de}
}