@phdthesis{vanAlen2010,
  author    = {van Alen, Tessa},
  title     = {Vergleichende Proteomanalyse von Biofilmen und planktonischen Zellen bei dem humanen Infektionserreger Neisseria meningitidis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52463},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Tr{\"a}gertum im Nasenrachenraum ist entscheidend f{\"u}r die {\"U}bertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Fr{\"u}here Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilm{\"a}hnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell f{\"u}r das Tr{\"a}gertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, w{\"a}hrend bisher keine Proteomanalysen durchgef{\"u}hrt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschl{\"a}uchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse {\"u}ber 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse {\"u}ber 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit {\"u}berwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verst{\"a}rkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn m{\"o}glich, mit spezifischen Antik{\"o}rpern abgesichert. Die Expression von ungef{\"a}hr 2 \% aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Ver{\"a}nderungen beobachtet, die mit einem N{\"a}hrstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden k{\"o}nnen. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erh{\"o}ht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell f{\"u}r Biofilmwachstum, nicht aber f{\"u}r planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator f{\"u}r metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte {\"u}ber die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adh{\"a}sine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.},
  subject      = {Biofilm},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Herrmann2009,
  author    = {Herrmann, Petra},
  title     = {Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37500},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen k{\"o}nnen im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, n{\"a}mlich die {\"U}berlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im {\"U}berschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit {\"u}berwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellul{\"a}r gewachsene Bakterien {\"u}ber Bindung an paramagnetische Partikel („Beads") und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gew{\"a}hlt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel \&\#61483; Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy - CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur f{\"u}r die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate f{\"u}r die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien w{\"a}hrend der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. F{\"u}r einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen" Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begr{\"u}ndet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen F{\"a}llen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellul{\"a}ren Ver{\"a}nderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten {\"u}bereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazellul{\"a}re posttranskriptionelle Mechanismen begr{\"u}ndet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Foerster2009,
  author    = {F{\"o}rster, Johanna R.},
  title     = {Identifizierung und Analyse von Proteininteraktionen bei zwei Mitgliedern der MAGUK-p55-Subfamilie, MPP4 und MPP5},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37269},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren das retinaspezifische palmitoylierte Membranprotein 4 (engl. membrane palmitoylated protein 4, MPP4) und das ubiquit{\"a}r exprimierte MPP5, die beide zur großen Familie der Membran-assoziierten Guanylatkinasen (engl. membrane-associated guanylate kinases, MAGUKs) geh{\"o}ren. Beide Proteine haben wichtige organisatorische Funktionen als Adapterproteine in der Netzhaut. MPP4 ist am Aufbau von pr{\"a}synaptischen Proteinkomplexen in den Photorezeptor-Ribbonsynapsen beteiligt. Ein Fehlen von MPP4 in M{\"a}usen f{\"u}hrt zum Verlust von einigen pr{\"a}synaptischen Proteinen von der Ribbonsynapse, was eine wichtige Rolle von MPP4 f{\"u}r die Organisation dieses Komplexes indiziert. Um neue Komponenten dieses Multiproteinkomplexes zu identifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein proteomischer Ansatz etabliert. Dazu wurde der MPP4-assoziierte Proteinkomplex aus Proteinextrakten der bovinen Retina durch Immunaffinit{\"a}tschromatographie isoliert, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und resultierende Protein-spots massenspektrometrisch analysiert. Diese Untersuchungen identifizierten 18 kopr{\"a}zipitierte Proteine. Darunter waren der bekannte Interaktionspartner Veli3 und das MAGUK-Protein PSD95. F{\"u}r letzteres konnte gezeigt werden, dass speziell die \&\#946;-Isoform von PSD95 mit MPP4 {\"u}ber die N-terminalen L27-Dom{\"a}nen heterodimerisiert. Daneben konnte die Assoziation von MPP4 mit Hsc70 und Recoverin durch unabh{\"a}ngige Bindungs-assays verifiziert werden, wobei diese Interaktionen indirekt waren und m{\"o}glicherweise von retinaspezifischen Proteinen vermittelt werden. Diese Ergebnisse unterst{\"u}tzen die herausragende Rolle von MPP4 als Ger{\"u}stprotein f{\"u}r die Organisation eines Proteinkomplexes der Photorezeptorsynapse, der an der Regulierung der Ca2+-Hom{\"o}ostase in den pr{\"a}synaptischen Enden, sowie vermutlich auch an der Exozytose der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Die {\"u}brigen kopr{\"a}zipitierten Proteine waren Bestandteile des Zytoskeletts und verschiedener Signalwege und wahrscheinlich unspezifische Kontaminanten. Das MPP5-Protein ist Teil eines evolution{\"a}r konservierten Proteinkomplexes, der f{\"u}r die Entstehung und Aufrechterhaltung der apikobasalen Polarit{\"a}t in Epithelzellen eine wichtige Rolle spielt und in der Netzhaut f{\"u}r die speziellen Zellverbindungen zwischen M{\"u}ller-Gliazellen und Photorezeptoren in der externen limitierenden Membran essentiell ist. Mutationen, die zu St{\"o}rungen in der Funktion dieses Proteinkomplexes f{\"u}hren, verursachen retinale Defekte bei Mensch (z.B. Retinitis Pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose), Maus, Zebrafisch und Fruchtfliege. Die PDZ-Dom{\"a}ne von MPP5 bindet an den C-Terminus der CRB-Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung einer Punktmutation in der PDZ-Dom{\"a}ne von MPP5 (V301N), funktionell untersucht. Diese hat im Zebrafisch eine fehlende Photorezeptoradh{\"a}sion und die Zerst{\"o}rung der retinalen Architektur zur Folge. Es wurde gezeigt, dass die V301N-Mutation die Interaktion zwischen MPP5 und den drei CRB-Isoformen verhindert. Außerdem f{\"u}hrt sie zu einer Fehllokalisierung von heterolog exprimiertem MPP5V301N in MDCK-Zellen, die zudem einen erh{\"o}hten transepithelialen Widerstand aufweisen. {\"U}ber quantitative real-time PCR wurde in diesen Zellen eine verminderte Genexpression von Untereinheiten des apikalen epithelialen Natriumkanals ENaC und der basolateralen Na+/K+-ATPase festgestellt, was die Ursache f{\"u}r einen verminderten Ionenfluss durch die Zellschicht darstellen k{\"o}nnte. Somit {\"u}bt heterolog exprimiertes MPP5V301N in MDCK-Zellen einen dominanten Effekt aus, der m{\"o}glicherweise {\"u}ber einen Einfluss auf die Genregulation bestimmter Proteine vermittelt wird. Zur Untersuchung welche Auswirkungen die MPP5V301N-Mutation in vivo hat, wurde eine MPP5V301N-knock-in-Mauslinie generiert. Die bisherige Charakterisierung der M{\"a}use zeigte bei heterozygoten Tieren keinen {\"a}ußerlich erkennbaren Ph{\"a}notyp, wohingegen homozygote M{\"a}use nicht lebensf{\"a}hig waren. Vermutlich f{\"u}hrt das Vorkommen beider mutanter Allele in fr{\"u}hen embryonalen Stadien zum Abstoßen der Embryos. Das Mausmodell bietet die Basis f{\"u}r weitere Untersuchungen {\"u}ber die molekularen Konsequenzen einer Expression von MPP5V301N in der Netzhaut und anderen Geweben und wird Beitr{\"a}ge zur Aufkl{\"a}rung von Entstehungsmechanismen CRB1-MPP5-assoziierter Netzhauterkrankungen liefern.},
  subject      = {Netzhaut},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Tribl2005,
  author    = {Tribl, Florian},
  title     = {Isolierung und Charakterisierung Neuromelanin-assoziierter Proteine aus Neuromelanin-Granula des menschlichen Gehirns mittels subzellul{\"a}rer Proteomanalyse},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16117},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen Untersuchungen zur Bildung des Pigments Neuromelanin, das die Ursache f{\"u}r die dunkle Farbgebung der humanen Substantia nigra pars compacta ist. Eine Beteiligung von Neuromelanin an den pathobiochemischen Ereignissen bei Parkinson-Krankheit erkl{\"a}rt das klinische Interesse an Neuromelanin. Die Untersuchungsm{\"o}glichkeiten von Neuromelanin sind limitiert: einerseits ist eine chemische Strukturaufkl{\"a}rung aufgrund der Unl{\"o}slichkeit dieses amorphen Polymers kaum zu bewerkstelligen, andererseits wird mangels geeigneter biologischer Testsysteme ein Einblick in die Biogenese von Neuromelanin verwehrt. Zurzeit wird die Bildung von Neuromelanin anhand der beiden konkurrierenden Hypothesen als Autoxidation von Dopamin oder durch Beteiligung eines Enzyms („Tyrosinase-Konzept") erkl{\"a}rt. In dieser Arbeit wurden beide hypothetischen Ans{\"a}tze bearbeitet, wobei einer enzymatischen Biogenese von Neuromelanin die Pr{\"a}ferenz gegeben wird. Zur globalen Untersuchung von Neuromelanin-Granula wurde nun erstmals eine Isolierung der Pigment-haltigen Organelle vorgestellt, die die Basis f{\"u}r eine umfassende Proteomanalyse mittels 1-D-SDS-PAGE und ESI-Tandem-Massenspektrometrie bildete. Mit diesem methodischen Ansatz wurden ingesamt 73 Proteinen identifiziert. Diese waren vor allem lysosomalen Proteinen zuordenbar, z.B. charakteristischen Membranproteinen (LAMP-1), s{\"a}mtlichen Proteasen, Proteinen des Metabolismus von (Glyco-)Lipiden und Glycoproteinen, aber auch Proteinen des Cytosols und des vesikul{\"a}ren Verkehrs. Entscheidend war die Anwesenheit von Proteinen des Endoplasmatischen Reticulums (ER); Calnexin gilt als ein melanogenes Chaperon, das nicht in Lysosomen vorkommt, dagegen aber in Lysosomen-verwandten Organellen. Im Vergleich mit bereits existierenden Proteinprofilen von Lysosomen und Lysosomen-verwandten Organellen zeigten die in Neuromelanin-Granula identifizierten lysosomalen Proteine und Proteine des ER, dass diese Organellen der humanen Substantia nigra keine konventionellen Lysosomen sind, sondern mit hoher Wahrscheinlichkeit der Gruppe der Lysosomen-verwandten Organellen zuzuordnen sind.},
  subject      = {Melanin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klug2003,
  author    = {Klug, Michael},
  title     = {Phasenvariation bei Legionella pneumophila: Vergleichende Proteomanalyse von virulenten und avirulenten Legionella pneumophila-St{\"a}mmen unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7464},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die St{\"a}mme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich ph{\"a}notypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfl{\"a}che, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.},
  language  = {de}
}