@phdthesis{Demler2021,
  author    = {Demler, Theresa},
  title     = {Funktionelle Analyse von patientenspezifischen Mutationen in IKZF1/3 als m{\"o}gliche Resistenzmechanismen in der Therapie des refrakt{\"a}ren und rezidivierten multiplen Myeloms},
  doi       = {10.25972/OPUS-24873},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-248730},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Trotz einer Vielzahl neuer Therapieans{\"a}tze in den letzten Jahren, die ein l{\"a}ngeres {\"U}berleben der Patienten erm{\"o}glichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refrakt{\"a}res multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifit{\"a}t: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Kr{\"o}nke et al. (2014) wurde eine 30 Aminos{\"a}uren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell f{\"u}r die Lenalidomid-Sensitivit{\"a}t ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. F{\"u}r diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilit{\"a}t (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bez{\"u}glich ihrer Implikationen f{\"u}r die Lenalidomid-Sensibilit{\"a}t untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D f{\"u}hrten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen f{\"u}hrte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivit{\"a}t und zu deutlich h{\"o}herem {\"U}berleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten f{\"u}r Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige {\"U}berexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschr{\"a}nkt zu verwerten. Zusammenfassend l{\"a}sst sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf m{\"o}gliche Therapieresistenzen haben k{\"o}nnen.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kerber2019,
  author    = {Kerber, Isabel},
  title     = {Einfluss von Punktmutationen auf die Funktionalit{\"a}t von NK-Zellen in Interaktion mit Aspergillus fumigatus},
  doi       = {10.25972/OPUS-18925},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-189256},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Punktmutationen in ifng und ncam1 in Hinblick auf eine ver{\"a}nderte Funktionalit{\"a}t von NK-Zellen bei der Interaktion mit A. fumigatus. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen langfristig zur Verbesserung der Diagnostik, Prophylaxe und Therapie einer Invasiven Aspergillose, die zum Beispiel im Rahmen einer Stammzelltransplantation auftreten k{\"o}nnte, beitragen. In dieser Arbeit wurde die DNA von zwanzig gesunden Spendern auf einen ifng-SNP (rs2069705) und einen ncam1-SNP (rs10502171) untersucht. Von je drei ausgew{\"a}hlten Spendern mit SNP und sechs Kontrollspendern wurden NK-Zellen isoliert. Diese wurden unstimuliert belassen, mit Interleukin 2/15 oder A. fumigatus stimuliert. Bei der Versuchsreihe zum ifng-SNP wurde eine qPCR zur Ermittlung der relativen Expression von ifng und ccl4, bei den Versuchen zum ncam1-SNP eine durchflusszytometrische Analyse zur Messung der Expression verschiedener Oberfl{\"a}chenmarker durchgef{\"u}hrt. Bei beiden wurde mittels ELISA die Freisetzung von IFN-gamma bzw. CCL4/MIP-1ß bestimmt. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zum ifng-SNP lassen vermuten, dass das Vorliegen dieses ifng-SNP keine durch NK-Zellen vermittelten Auswirkungen auf das Risiko der Patienten, an einer Invasiven Aspergillose zu erkranken, hat. In Bezug auf den ncam1-SNP konnte die Hypothese best{\"a}tigt werden, dass der SNP die Interaktion zwischen der NK-Zelle und A. fumigatus ver{\"a}ndert. Der SNP korreliert zwar mit einer erh{\"o}hten Grundaktivierung von NK-Zellen, jedoch auch mit einem schw{\"a}cheren Aktivierungspotential bei Stimulation mit dem Pilz.},
  subject      = {Punktmutation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zimmermann2012,
  author    = {Zimmermann, Melanie Andrea},
  title     = {Charakterisierung und Expressionsanalysen von H{\"a}mophilie-A-Mutationen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Bei einem kleinen Prozentsatz (2-3 \%) aller molekulargenetisch untersuchten H{\"a}-mophilie-A-F{\"a}lle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der H{\"a}mophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zus{\"a}tzlicher Methoden aufgekl{\"a}rt werden. Bei zwei Patienten mit milder H{\"a}mophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalit{\"a}t dieser Austausche zu {\"u}berpr{\"u}fen, wurden f{\"u}r diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgef{\"u}hrt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivit{\"a}t des Promotors deutlich herabsetzen und daher als urs{\"a}chlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die {\"u}brigen Patienten auf epigenetische Ver{\"a}nderungen in f{\"u}nf CpG-Inseln im 5'UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auff{\"a}llige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Ver{\"a}nderungen im Intron 1 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen k{\"o}nnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalit{\"a}t der Mutationen gekl{\"a}rt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 \%) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) {\"u}berein, w{\"a}hrend es bei 22 \% der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten H{\"a}mophilie-A-Patienten aufgekl{\"a}rt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen f{\"u}hren k{\"o}nnen und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter N{\"a}he der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen H{\"a}mophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer H{\"a}mophilie A aufgefallen, welche ungew{\"o}hnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auff{\"a}lligen Bandenmuster nicht erkl{\"a}ren konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass f{\"u}nf der untersuchten F{\"a}lle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellul{\"a}ren Expressionssystem durchgef{\"u}hrt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Dom{\"a}nen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Dom{\"a}nen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazellul{\"a}re Immunlokalisation der trunkierten Proteine best{\"a}tigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Dom{\"a}ne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen erm{\"o}glicht und das FVIII-Protein vor Degradation sch{\"u}tzt.},
  subject      = {H{\"a}mophilie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Moeller2011,
  author    = {M{\"o}ller, Christian},
  title     = {Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase bei Patienten mit famili{\"a}rer dilatativer Kardiomyopathie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74278},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Die Arbeitsgruppe Zimmer am Institut f{\"u}r Klinische Biochemie und Pathobiochemie der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg detektierte im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLD) eine bisher nicht bekannte Mutation, die f{\"u}r die Entwicklung einer famili{\"a}ren Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) verantwortlich ist. Die DLD spielt als Teil von mitochondrialen Enzymkomplexen eine wichtige Rolle im Energie- und Aminos{\"a}urestoffwechsel der Zelle. Mutationen im DLD-Gen f{\"u}hren dabei meist zu neurologischen Syndromen mit Erscheinungsbildern wie mentaler Entwicklungsverz{\"o}gerung, Krampfanf{\"a}llen und spastischen Bewegungsst{\"o}rungen. F{\"a}lle von Herzinsuffizienz und fr{\"u}hkindlicher Hypertropher Kardiomyopathie wurden ebenfalls beschrieben. Von den zahlreichen Gendefekten, die als Ausl{\"o}ser f{\"u}r die dilatative Kardiomyopathie bekannt sind, ist bisher noch keiner im Gen der DLD beschrieben worden. Vielmehr sind DCM-Mutationen in Genen zu finden, die f{\"u}r muskelspezifische Proteine kodieren. Dadurch f{\"u}hren sie oft zu einer Beeinflussung der Kraft{\"u}bertragung im Sarkomer. Die durch die Arbeitsgruppe Zimmer beschriebene DLD-Mutation wurde in einer portugiesischen Großfamilie entdeckt, in welcher das Auftreten der dilatativen Kardiomyopathie {\"u}ber mehrere Generationen hinweg zu verfolgen ist. {\"A}hnliche F{\"a}lle außerhalb dieser Familie sind nicht bekannt. Demnach gibt es keine Daten, die die H{\"a}ufigkeit DCM-assoziierter Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase beschreiben. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigte sich damit weitere Zusammenh{\"a}nge zwischen genetischen Alterationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer DCM aufzudecken. In diesem Rahmen wurden DCM-Patienten, die erwiesenermaßen an einer famili{\"a}ren Form dieser Erkrankung leiden, gezielt auf Ver{\"a}nderungen in den Exons des DLD-Gens untersucht. Insgesamt wurden die Exons von 88 Patienten auf das Vorhandensein heterozygoter Mutationen {\"u}berpr{\"u}ft. Hierf{\"u}r wurden PCR-Produkte, die die jeweiligen Exons enthielten, mit Hilfe der Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) untersucht. Diese Methode erm{\"o}glicht eine hochsensitive und gleichermaßen {\"a}ußerst spezifische Detektion heterozygoter Mutationen. Auff{\"a}llige Ergebnisse wurden anschließend mittels Sequenzierung verifiziert. Insgesamt wurden bei elf Patienten f{\"u}nf unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Es handelte sich um vier bereits bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen und eine bisher nicht beschriebene Mutation. Dabei lagen vier Mutationen in nicht n{\"a}her bezeichneten Intron-Bereichen, eine Mutation in einer 3' Spleißstelle und eine weitere Mutation in der 3' UTR (untranslated region) der mRNA. Somit befanden sich also einige Mutationen an f{\"u}r die Regulation der Genfunktion strategisch wichtigen Positionen. Da es sich dabei um bekannte Polymorphismen handelte, wurde mit Hilfe der Daten des HapMap Projekts {\"u}berpr{\"u}ft, ob es bereits Hinweise f{\"u}r eine klinische Assoziation gab. Die Daten zeigten, dass bisher keiner der hier detektierten SNPs mit klinischen Erscheinungsbildern in Verbindung gebracht werden konnte. Es gab auch keine Hinweise daf{\"u}r, dass die erfassten SNPs im Patientenkollektiv h{\"a}ufiger vorkamen als in der Normalbev{\"o}lkerung. Einer der hier beschriebenen Mutationen war nicht in den verwendeten Datenbanken aufgef{\"u}hrt. Daher kann ein pathologischer Einfluss dieser Mutation zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund ihrer Lage in einem weit vom Exon entfernten Intron-Bereich nicht offensichtlich. Es ließen sich also f{\"u}r keine der detektierten Mutationen pathogene Eigenschaften nachweisen. In Protein-kodierenden Sequenzbereichen konnten keine Mutationen nachgewiesen werden. Abschließend l{\"a}sst sich also sagen, dass eine Assoziation zwischen Mutationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer famili{\"a}ren DCM im Rahmen dieser Arbeit nicht best{\"a}tigt werden konnte. Es ist jedoch m{\"o}glich, dass DCM-assoziierte Mutationen im DLD-Gen nur {\"a}ußerst selten auftreten oder aber die durch die Arbeitsgruppe Zimmer detektierte Mutation im DLD-Gen die bisher einzige ist, die mit DCM in Verbindung gebracht werden kann. Um diese Frage zu kl{\"a}ren m{\"u}ssen Untersuchungen mit gr{\"o}ßeren Patientenkollektiven angeschlossen werden.},
  subject      = {Kongestive Herzmuskelkrankheit},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Huberth2009,
  author    = {Huberth, Andreas},
  title     = {MLC1/KIAA0027 als Kandidatengen f{\"u}r Periodische Katatonie - Eine Mutationsanalyse bei einer betroffenen Großfamilie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50903},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Die Periodische Katatonie ist eine diagnostisch gut abgrenzbare Untergruppe der Schizophrenie mit besonders großer famili{\"a}rer Belastung. Durch Kopplungsuntersuchungen konnte eine Kopplung der Erkrankung mit Chromosom 22q13 gezeigt werden. In der Zielregion befindet sich auch das MLC1-Gen (alternative Bezeichnungen WKL1 oder KIAA0027), f{\"u}r welches bereits eine Assoziation mit einer anderen erblichen Hirnerkrankung, der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten (MLC), bekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte nun eine Mutationsanalyse von MLC1 als Kandidatengen f{\"u}r die Periodische Katatonie am Material einer mehrfach betroffenen Großfamilie. Durch Verl{\"a}ngerung der bekannten partiellen cDNA-Sequenz von MLC1 mittels 5'-RACE ergab sich unter Annahme des von Nomura et al. (1994) beschriebenen offenen Leserasters ein 377 Aminos{\"a}uren großes Protein. Die Strukturanalyse des vorhergesagten MLC1-Proteins zeigt die gr{\"o}ßte {\"U}bereinstimmung f{\"u}r den humanen spannungsgesteuerten Kaliumkanal KCNA1. In der Vergangenheit konnte bereits bei anderen neurologischen Erkrankungen ein Zusammenhang mit ver{\"a}nderten Kaliumkanalproteinen nachgewiesen werden. In der bekannten genomischen DNA-Sequenz konnten 12 Exons annotiert werden. Bei der Sequenzierungsanalyse der codierenden Genabschnitte von MLC1 fand sich bei allen erkrankten Mitgliedern der untersuchten Multiplexfamilie ein heterozygoter Austausch von Cytosin zu Adenin an mRNA-Position 1121 (Gen-Bank Accession-Nummer AF319633). Diese Punktmutation f{\"u}hrt zu einem Aminos{\"a}ureaustausch von Leucin zu Methionin im MLC1-Protein. Bei einigen nicht erkrankten Familienmitgliedern ließ sich die ver{\"a}nderte DNA-Sequenz ebenfalls nachweisen, was jedoch durch eine unvollst{\"a}ndige Krankheitspenetranz oder einen sp{\"a}teren Erkrankungszeitpunkt begr{\"u}ndet sein k{\"o}nnte. In einem Kontrollkollektiv von 327 Probanden aus der Normalbev{\"o}lkerung sowie bei je einem erkrankten Mitglied von drei anderen mehrfach von periodischer Katatonie betroffenen Familien konnte die Missense-Mutation nicht gefunden werden. In dieser Arbeit wurde die Assoziation einer sinnver{\"a}ndernden Mutation im MLC1-Gen mit dem Auftreten von periodischer Katatonie in einer mehrfach betroffenen Familie gezeigt. Die Aufkl{\"a}rung der Funktion von MLC1 verspricht somit wichtige Erkenntnisse zur {\"A}tiopathogenese sowohl der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten als auch der Periodischen Katatonie.},
  subject      = {Genmutation},
  language  = {de}
}