@phdthesis{Friedrich2015,
  author    = {Friedrich, Alexandra},
  title     = {Beeinflussung des Na+-D-Glukose-Kotransporters SGLT1 und der Na+-Nukleosidtransporter CNT durch Peptidmotive des Regulatorproteins RS1 im Darm},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127394},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein f{\"u}r SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Dom{\"a}ne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschn{\"u}rung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abh{\"a}ngig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 f{\"u}hrte, w{\"a}hrend der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabh{\"a}ngigen Regulation konnte f{\"u}r SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. F{\"u}r die CNTs war eine derartige Zuckerabh{\"a}ngigkeit nicht zu beobachten. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem S{\"a}ugetier gezeigt werden k{\"o}nnen. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Dom{\"a}ne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gew{\"a}hrleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, w{\"a}hrend die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren f{\"u}hrte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was f{\"u}r eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass {\"u}ber Nanohydrogele l{\"a}ngere Proteine in die Zelle gebracht werden k{\"o}nnen und dort funktionell freigesetzt werden.},
  subject      = {Glucosetransport},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Spannaus2015,
  author    = {Spannaus, Ralf},
  title     = {Regulation der foamyviralen Proteaseaktivit{\"a}t},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113401},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation k{\"o}nnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschr{\"a}nktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2' und P2 auf die Aminos{\"a}urereste Valin und Valin/Asparagin beschr{\"a}nkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschr{\"a}nkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollst{\"a}ndige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivit{\"a}t-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollst{\"a}ndige cDNA bilden k{\"o}nnen. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilit{\"a}t der wenigen Env-Trimere auf der H{\"u}llmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molek{\"u}l als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschr{\"a}nkten Env-Mobilit{\"a}t, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da f{\"u}r die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleins{\"a}ure ben{\"o}tigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Dom{\"a}nen f{\"u}r die Aktivierung der Protease ben{\"o}tigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivit{\"a}t resultierte, war die funktionelle RNaseH-Dom{\"a}ne essenziell f{\"u}r die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Dom{\"a}nen von anderen Retroviren resultierte in genomunabh{\"a}ngiger Proteaseaktivit{\"a}t in Zellen und genomabh{\"a}ngiger Proteaseaktivit{\"a}t in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden.},
  subject      = {Spumaviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaeffler2011,
  author    = {Sch{\"a}ffler, Katrin M.},
  title     = {Regulation der eukaryotischen Translation durch RNA-bindende Faktoren: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des La-verwandten Proteins 4B (LARP4B)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69809},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {In Zellen liegen RNAs in Form von Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) vor, wobei das Zusammenwirken von RNA und Proteinen die Funktionen der einzelnen RNPs definiert. RNA-bindenden Proteinen kommt demnach eine zentrale Bedeutung beim Verst{\"a}ndnis des RNA-Metabolismus zu. Zu dieser Proteingruppe z{\"a}hlen auch die La-verwandten Proteine (engl. La-related proteins, LARPs), welche eine evolution{\"a}r konservierte Familie von Faktoren bilden und durch eine putative RNA-bindende Dom{\"a}ne, dem La Modul, charakterisiert sind. Bereits f{\"u}r zwei Vertreter dieser Proteinklasse (LARP3 und LARP7) konnte eine {\"u}ber das La Modul vermittelte spezifische Interaktion mit uridylreichen RNA-Sequenzen gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Vertreter der LARP-Familie, das sogenannte LARP4B, sowohl biochemisch als auch strukturell zu untersuchen und es somit einem zellul{\"a}ren Prozess zuzuordnen. Zellbiologische Studien zeigten zun{\"a}chst, dass LARP4B unter normalen Wachstumsbedingungen eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufweist. Unter Stressbedingungen akkumuliert LARP4B hingegen in diskreten subzellul{\"a}ren Dom{\"a}nen, den sogenannten Stress Granules (SGs). Obwohl SGs bislang noch wenig funktionell untersucht sind, wird davon ausgegangen, dass sie der reversiblen Speicherung von mRNA-gebundenen Translationsfaktoren dienen. Durch affinit{\"a}tschromatographische Strategien ließen sich spezifische Interaktionspartner von LARP4B identifizieren. Als direkte Bindungspartner wurden das zytoplasmatische Poly (A) bindende Protein 1 (PABPC1) und der Rezeptor f{\"u}r aktivierte C Kinase 1 (RACK1) gefunden. Dar{\"u}ber hinaus zeigten Sedimentationsanalysen, dass LARP4B nahezu quantitativ mit Ribosomen und Polyribosomen assoziiert vorliegt. Diese Studie identifizierte daher LARP4B als ein Protein, das mit Schl{\"u}sselfaktoren der eukaryotischen Translation wechselwirkt. In {\"U}bereinstimmung mit diesen Befunden reduziert ein RNAi-induzierter Mangel des Proteins die Translationsrate drastisch, w{\"a}hrend die {\"U}berexpression von LARP4B in vivo zu einer Stimulation der Proteinbiosynthese f{\"u}hrt. Da dieser stimulatorische Einfluss bei einer Vielzahl unterschiedlicher mRNA-Spezies detektiert werden konnte, kann LARP4B als genereller, positiver Translationsfaktor angesehen werden. Interessanterweise wurden in Studien, die zeitgleich f{\"u}r das verwandte LARP1 durchgef{\"u}hrt wurden, vergleichbare zellul{\"a}re Interaktionen wie f{\"u}r LARP4B beschrieben. Um zu kl{\"a}ren, ob beide LARPs Orthologe darstellen und funktionelle Redundanz zeigen, wurde in der vorgelegten Arbeit ein Vergleich von LARP4B mit LARP1 durchgef{\"u}hrt. Unabh{\"a}ngige in vivo Studien und Sedimentationsanalysen zeigten deutlich, dass beide Proteine im mRNA-Metabolismus agieren, jedoch in diesem unterschiedliche Phasen der eukaryotischen Proteinbiosynthese beeinflussen.},
  subject      = {Translation <Genetik>},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stingl2011,
  author    = {Stingl, Nadja},
  title     = {Regulation der Jasmonatbiosynthese durch Lipasen in Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56393},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Lipasen regulieren die Biosynthese von Jasmonaten, die eine elementare Signalfunktion bei der Entwicklung von Pflanzen und der Abwehr von Pathogenen haben. Entsprechend dem klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway" dienen die aus Galaktolipiden freigesetzten Fetts{\"a}uren α-18:3 und 16:3 als Substrate der Jasmons{\"a}ure (JA)-Synthese. In den letzen zehn Jahren wurden jedoch die Intermediate der JA-Biosynthese 12-Oxo-Phytodiens{\"a}ure (OPDA, ausgehend von α-18:3) und Dinor-12-Oxo-Phytodiens{\"a}ure (dnOPDA, ausgehend von 16:3) verestert in Galaktolipiden der Art Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Die Biosynthese und die m{\"o}giche Speicherfunktion dieser komplexen, als Arabidopside bezeichneten, Lipide war jedoch noch unklar. In der Literatur wird ein alternativer Syntheseweg postuliert, in dem analog zum klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway" die Biosynthese von veresterter OPDA/dnOPDA ausgehend von veresterter α-18:3/16:3 vollst{\"a}ndig in Galaktolipiden der Pastidenmembran stattfindet. Nach Freisetzung von OPDA/dnOPDA durch eine Lipase k{\"o}nnten OPDA/dnOPDA dann als Intermediate in die JA-Biosynthese einfliessen. Sowohl im klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway" als auch im postulierten alternativen Syntheseweg ist die Aktivit{\"a}t von Lipasen von essentieller Bedeutung f{\"u}r die JA-Biosynthese. F{\"u}r zwei plastid{\"a}re sn1-spezifische Acyl-Hydrolasen, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) und DONGLE (DGL), wurde eine zentrale Funktion innerhalb der Jasmonat-Biosynthese in Bl{\"a}ttern von A. thaliana beschrieben. Dem zufolge ist DGL f{\"u}r die basalen und die fr{\"u}hen wundinduzierten JA-Gehalte und DAD1 f{\"u}r die Aufrechterhaltung der erh{\"o}hten JA-Konzentrationen in der sp{\"a}teren Verwundungsantwort verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wiesen drei unabh{\"a}ngige DGL-RNAi-Linien sowie DAD1-Knock-out-Mutanten sowohl unter basalen Bedingungen als auch zu fr{\"u}hen Zeitpunkten nach Verwundung sowie nach Infektion mit dem Bakterienstamm P. syringae DC3000 (avrRPM1) mit dem Wildtyp vergleichbare Konzentrationen an OPDA/JA auf. Dies steht im klaren Widerspruch zu den publizierten Daten. Die Beteiligung von DAD1 an der OPDA/JA-Biosynthese zu sp{\"a}ten Zeitpunkten nach Verwundung konnte jedoch best{\"a}tigt werden. Ferner konnte eine dramatische {\"U}ber-Akkumulation von Arabidopsiden in DAD1-defizienten Mutanten nach Verwundung nachgewiesen werden, was auf eine Beteiligung von DAD1 bei der Freisetzung von membrangebundener OPDA/dnOPDA hinweist. Die Analyse der Einzelmutanten 16 weiterer plastid{\"a}rer Lipasen unter basalen Bedingungen, nach Verwundung und nach Infektion mit P. syringae DC3000 (avrRPM1) zeigte, dass keine der analysierten Mutanten eine essentielle Rolle in der JA-Biosynthese spielt. Jedoch wiesen Mutanten der sn1-spezifischen Lipasen AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) signifikant niedrigere Konzentrationen an dnOPDA, OPDA und JA nach Verwundung auf, was eine indirekte Beteiligung an der JA-Biosynthese vermuten l{\"a}sst. Blattgewebe einer Quadrupel-Mutanten, welche defizient in vier DAD1-{\"a}hnlichen Lipasen (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) ist, wies nach Verwundung mit der AtPLA1-Iγ1-Mutante vergleichbar niedrige Gehalte an dnOPDA, OPDA sowie JA auf. Da stets in sn2-Position vorliegende 16:3/dnOPDA ebenfalls Substrat der JA-Biosynthese sein kann, m{\"u}ssen zus{\"a}tzlich zu DAD1 und AtPLA1-Iγ1 noch weitere nicht identifizierte sn1- und sn2-spezifische Acyl-Hydrolasen an der JA-Biosynthese nach Verwundung und Pathogeninfektion beteiligt sein. Dies bedeutet, dass entgegen der in der Literatur vertretenen Meinung, nicht eine sondern mehrere Lipasen in redundanter Weise die Biosynthese von Jasmonaten regulieren. Zur Aufkl{\"a}rung der Biosynthese und m{\"o}glichen Speicherfunktion der ausschließlich in Arabidopsis vorkommenden Arabidopside wurden A. thaliana Keimlinge mit D5-Linolens{\"a}ure-Ethylester inkubiert, um eine D5-Markierung der komplexen Lipide zu erzielen. Durch einen anschließenden Stressstimulus mittels Zugabe von Silbernitrat wurde die Jasmonat-Synthese induziert. Die vergleichende Analyse der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide MGDG, DGDG, PC sowie der freien OPDA und JA vor und nach Zugabe des Silbernitrats zeigte, eine hohe {\"U}bereinstimmung der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B (MGDG-OPDA-OPDA) und Arabidopsid G (OPDA-MGDG-OPDA-OPDA) vor der Silbernitratbehandlung mit denjenigen der durch Silbernitratbehandlung neu gebildeten OPDA/JA. Dagegen wird die hochmarkierte freie Linolens{\"a}ure nicht direkt zu freier OPDA umgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G direkte Vorstufen von freier OPDA sein k{\"o}nnen. Damit {\"u}bereinstimmend konnte gezeigt werden, dass nach Silbernitratstress die Spiege der Vorstufe 18:3-18:3-MGDG abnehmen und zeitgleich die entsprechenden unmittelbaren Metabolite 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G akkumulieren.},
  subject      = {Lipasen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Humrich2009,
  author    = {Humrich, Jan},
  title     = {G-Protein betagamma-Regulation durch Phosducin-like Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40059},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der L{\"a}nge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquit{\"a}r exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abh{\"a}ngigen Funktionen f{\"u}hrt. Der um 83 Aminos{\"a}uren verl{\"a}ngerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches f{\"u}r die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte {\"u}berraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator f{\"u}r Gbetagamma-abh{\"a}ngige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden F{\"a}higkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verl{\"a}ngerten N-Terminus durch die ubiquit{\"a}re Casein Kinase 2 (CK2) zur{\"u}ckgef{\"u}hrt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) f{\"u}hrte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsf{\"a}higkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinit{\"a}t nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsf{\"a}higkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminos{\"a}ure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsf{\"a}higkeit, als auch die F{\"a}higkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuh{\"a}ngen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinf{\"a}rbung) nicht die Funktionsf{\"a}higkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu k{\"o}nnen. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass m{\"o}glicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein k{\"o}nnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Dom{\"a}nen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma f{\"u}hrte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.},
  subject      = {G-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Homburg2007,
  author    = {Homburg, Stefan},
  title     = {Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli-Wildst{\"a}mmen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22884},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-St{\"a}mmen zu treffen, f{\"a}llt h{\"a}ufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen St{\"a}mmen gefunden werden k{\"o}nnen. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren" auf. Dazu geh{\"o}ren verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten l{\"a}sst daher R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen {\"o}kologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizellul{\"a}re Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Ph{\"a}notyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsf{\"a}higkeit gegen{\"u}ber anderen kommensalen E. coli erh{\"o}ht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabh{\"a}ngig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen m{\"o}glichen {\"u}bergeordneten Regulator dieses Ph{\"a}notyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht daf{\"u}r bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. W{\"a}hrend die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberfl{\"a}chenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colans{\"a}ure, LPS) einen ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten F{\"a}llen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abh{\"a}ngig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine f{\"u}r die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die St{\"a}mme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel f{\"u}hrte zur Aufhebung des zytopathischen Ph{\"a}notyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abget{\"o}tete Bakterien oder Kultur{\"u}berst{\"a}nde zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Dom{\"a}nen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher St{\"a}rke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erh{\"o}hte Transkription oder Promotoraktivit{\"a}t einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabh{\"a}ngigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabh{\"a}ngigkeit konnte durch die Induktion bzw. {\"U}berexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schl{\"u}sselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem m{\"o}glichen Regulator clbR nicht {\"u}berwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivit{\"a}t einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, welches {\"u}ber CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die nat{\"u}rliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis f{\"u}r einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und k{\"o}nnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen.},
  subject      = {Escherichia coli},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kroiss2006,
  author    = {Kroiß, Matthias},
  title     = {Die subzellul{\"a}re Verteilung des Regulatorproteins RS1 in Nierenepithelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20712},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazellul{\"a}re Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antik{\"o}rper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden daf{\"u}r erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellul{\"a}r an Vesikeln sowie an einem perinukle{\"a}ren Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukle{\"a}ren Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde {\"u}berwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erh{\"o}ht und gegenl{\"a}ufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit fr{\"u}her gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schl{\"u}ssigen Konzept zusammenf{\"u}hrt.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Brockmann2005,
  author    = {Brockmann, J{\"o}rg},
  title     = {Regulation G-Protein-gekoppelter Rezeptorkinasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15320},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {GRK2 wird an Serin29 durch PKC phosphoryliert. Die Phosphorylierung verhindert die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin. Die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin wird durch den N-Terminus der GRK2 vermittelt und ist auf eine gest{\"o}rte Aktivierbarkeit der GRK2 durch G-Protein beta/gamma-Untereinheiten zur{\"u}ckzuf{\"u}hren.},
  subject      = {Rezeptor-Kinasen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Brand2005,
  author    = {Brand, Normen},
  title     = {Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gew{\"a}hrleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform f{\"u}r weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abh{\"a}ngigkeit von Cdc6 und Cdt1 den pr{\"a}-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase f{\"u}r die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies erm{\"o}glicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen f{\"u}r drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und r{\"a}umlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivit{\"a}t und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgef{\"u}hrt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate f{\"u}r die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufkl{\"a}rung von Protein-Protein-Interaktionen ist f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Vorg{\"a}nge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 \& Orc3, Orc2 \& Orc4, Orc2 \& Orc5, Orc4 \& Orc6, Plk1 \& Orc2 und Plk1 \& Dbf4 gezeigt werden. Zus{\"a}tzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abh{\"a}ngigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch {\"u}berexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung f{\"u}r die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschr{\"a}nkt ist. Mit der erst k{\"u}rzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukle{\"a}re Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukle{\"a}re Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilit{\"a}t des bin{\"a}ren Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erh{\"o}hten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 f{\"u}hrt. Zus{\"a}tzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzellul{\"a}re Lokalisation und die intranukle{\"a}re Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilit{\"a}t von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Timmermann2005,
  author    = {Timmermann, Meike},
  title     = {Zellul{\"a}re Regulation und klinische Aspekte des monocyten-/macrophagenspezifischen Proteins CD163},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16028},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde die zellul{\"a}re Regulation des monocyten-/ macrophagenspezifischen Oberfl{\"a}chenproteins CD163 untersucht und klinische Aspekte der l{\"o}slichen Form des CD163 (sCD163) diskutiert. sCD163 wird in vivo durch einen inflammatorischen Reiz von der Zelloberfl{\"a}che abgespalten. Bislang waren jedoch noch keine Mediatoren charakterisiert worden, die immer unter Entz{\"u}ndungsbedingungen vorhanden sind. In den eigenen Untersuchungen des Shedding von CD163 konnten f{\"u}r die Generierung des sCD163 neue endogene Aktivatoren identifiziert werden. Sowohl reaktive Sauerstoffspezies, wie Wasserstoffperoxid oder Stickstoffmonoxid, als auch das Produkt von endogenen Oxidationsreaktionen mit reaktiven Sauerstoffspezies 8-iso Prostaglandin F2a erwiesen sich als potente Aktivatoren des Shedding von CD163. Neben den bekannten physiologischen Funktionen des 8-iso Prostaglandin F2a konnte erstmals eine neue Funktion bei Entz{\"u}ndungen definiert werden. Dieser Effekt wurde spezifisch durch 8-iso Prostaglandin F2a hervorgerufen, da das isomere Prostaglandin F2a unter gleichen Bedingungen keinen Einfluss auf das Shedding von CD163 aus{\"u}bte. Das Immunsuppressivum Cyclosporin A konnte ebenfalls als Induktor des Shedding von CD163 ermittelt werden. Damit konnte zus{\"a}tzlich zur bekannten immunmodulatorischen Wirkung des Cyclosporin A eine weitere antiinflammatorische Wirkung {\"u}ber Monocyten/Macrophagen aufgezeigt werden. Durch Untersuchungen der Inhibierung des Shedding von CD163 konnten Gemeinsamkeiten bez{\"u}glich der in die sCD163-Generierung involvierten Mediatoren dargestellt werden. Obwohl die untersuchten Verbindungen wahrscheinlich {\"u}ber unterschiedliche Signalwege das Shedding von CD163 induzieren, waren die Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies und intrazellul{\"a}rem Calcium und die Beteiligung einer TIMP-3-sensitiven Metalloproteinase an diesem Prozess essentiell. Bei einem Vergleich zwischen dem Shedding von CD163 und Tumor necrosis factor-a (TNF-a) ergaben sich Gemeinsamkeiten durch die Induktion des Shedding beider Verbindungen durch 8-iso Prostaglandin F2a und in sehr viel geringerem Maße durch Wasserstoffperoxid. Im Gegensatz dazu waren deutliche Unterschiede in dem Ausmaß der induzierten Stimulation des Shedding durch Stickstoffmonoxid, Prostaglandin F2a und Cyclosporin A zu erkennen. Im Hinblick auf die entgegengesetzten Wirkungen von sCD163 als antiinflammatorisch wirkende Verbindung und TNF-a als proinflammatorisches Cytokin, konnte dargestellt werden, dass die Freisetzung durch unterschiedliche Aktivatoren erfolgt. Nach Bestimmung der Konzentrationen von sCD163 und 8-iso PGF2a in bronchoalveol{\"a}rer Lavage-Fl{\"u}ssigkeit von Patienten mit Cystischer Fibrose konnten keine abschließende Aussagen {\"u}ber die Eignung beider Parameter als biologische Marker f{\"u}r chronische Entz{\"u}ndungen der Lunge bei diesen Patienten getroffen werden. Weiterf{\"u}hrend zu der Kenntnis, dass sCD163 die antiinflammatorische Wirkung {\"u}ber eine Interaktion des Proteins mit humanen T-Lymphocyten und nachfolgender Hemmung der Proliferation dieser Zellen aus{\"u}bt, wurde diese Wechselwirkung genauer untersucht. In quantitativen Bestimmungen des sCD163 in isolierten T-Lymphocyten verschiedener Spender konnte erstmals gezeigt werden, dass sCD163 zu einem Teil konstitutiv in die T-Lymphocyten aufgenommen wird und dass diese Aufnahme durch proinflammatorische Aktivierung der T-Lymphocyten stark gesteigert werden kann. Durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen unstimulierter T-Lymphocyten konnte die intrazellul{\"a}re Lokalisation des sCD163 visualisiert werden. Nach Aktivierung der Zellen mit einem proinflammatorischen Reiz fand innerhalb der Zellen eine Translokalisation des sCD163 aus dem cytoplasmatischen Bereich zur Zellmembran statt. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass abh{\"a}ngig vom Aktivierungsstatus der T-Lymphocyten eine Umverteilung des sCD163 innerhalb der Zellen erfolgt. Eine quantitative Bestimmung des sCD163 und seines Bindungspartners in T-Lymphocyten nichtmuskul{\"a}res Myosin Typ IIA gelang mittels eines neu entwickeltem ELISA, der spezifisch sCD163 und Myosin ausschließlich im Komplex erfasst. Damit konnte durch die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen ein grundlegender Beitrag zur Charakterisierung der Regulation der Proteinexpression und des Shedding von CD163 in humanen Monocyten sowie der Interaktion des sCD163 mit T-Lymphocyten geleistet werden.},
  subject      = {Antigen CD163},
  language  = {de}
}