@phdthesis{Hiltensperger2013, author = {Hiltensperger, Georg}, title = {4-Chinolon-3-carboxamide: Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung der afrikanischen Schlafkrankheit}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83416}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die humane afrikanische Trypanosomiasis (Schlafkrankheit, HAT) wird durch die Parasiten Trypanosoma brucei rhodesiense und Trypanosoma brucei gambiense ausgel{\"o}st und f{\"u}hrt unbehandelt zum Tod. Wegen begrenzter Therapiem{\"o}glichkeiten sowie vernachl{\"a}ssigter Kontrollprogramme ist HAT eine gegenw{\"a}rtige Bedrohung, was die Suche nach neuen Wirkstoffen notwendig macht. Ausgangspunkt f{\"u}r die Leitstrukturfindung war das 7-Amino-4-chinolon-3-carboxamid IV mit einem IC50-Wert (T. b. brucei) von 1.2 µM. Die 4-Chinolon-3-carboxamid-Grundstrukturen wurden unter Verwendung der Gould-Jacobs- (1-Alkyl-Derivate) bzw. der Grohe-Heitzer-Synthese (1-Aryl-Derivate) aufgebaut und anhand strukturierter Variation der Substituenten in Pos. 1, 3 und 7 die f{\"u}r die antitrypanosomale Wirksamkeit essenziellen Strukturelemente identifiziert: Pos.1: Die Alkylkettenverl{\"a}ngerung von Ethyl zu n-Butyl bewirkte eine stetige Aktivit{\"a}tssteigerung, welche auch einem Aryl-Rest in dieser Position {\"u}berlegen war. Pos.3: Benzylamide mit HBD-Funktionen f{\"u}hrten zur Aktivit{\"a}tsabnahme, w{\"a}hrend HBA-Funktionen und unsubstituierte Reste zur Steigerung der Wirksamkeit, teilweise in den nanomolaren Konzentrationsbereich, beitrugen. Pos.7: Neben cyclischen sek. Aminen wurden auch aliphatische prim. Amine via konventioneller oder Mikrowellen-unterst{\"u}tzter SNAr eingef{\"u}hrt. Dabei zeigten sich die sek. Amine mit einer antitrypanosomalen Aktivit{\"a}t im teilweise submikromolaren Bereich den acyclischen Aminen deutlich {\"u}berlegen. Vor allem der Morpholin-Rest bewirkte eine sprunghafte Wirksamkeitsverbesserung. Durch Kombination der Einzelresultate konnte schließlich die den Lipinski's „Rule of 5" entsprechende Leitstruktur 33 mit vielversprechender antitrypanosomaler Wirksamkeit (IC50 (T. b. brucei) = 47 nM, IC50 (T. b. rhodesiense) = 9 nM) und geringer Zytotoxizit{\"a}t erhalten werden (SI = 19000). Erste Untersuchungen zur Identifikation des Targets der 4-Chinolon-3-carboxamide ergaben folgende Erkenntnisse: Fluoreszenzmikroskopieuntersuchungen zeigten eine deutliche Ver{\"a}nderung der Morphologie des Mitochondriums bei behandelten BSF-T. b. brucei-Zellen. Anhand einer Zellzyklus-Analyse wurde die Beeintr{\"a}chtigung der Segregation des Kinetoplasten beobachtet, was zu einem Segregationsdefekt f{\"u}hrte. Die Topoisomerase (TbTopoIImt) wurde durch ein „Knockdown"-Experiment als Haupt-Target ausgeschlossen. Trotz der bemerkenswerten biologischen Aktivit{\"a}t war eine In-vivo-Untersuchung der Leitstruktur wegen zu geringer Wasserl{\"o}slichkeit nicht m{\"o}glich, welche auf eine hochgeordnete Schichtgitterstruktur zur{\"u}ckzuf{\"u}hren war. Da die L{\"o}slichkeit im Wesentlichen eine Funktion der Lipophilie und der intermolekularen Wechselwirkungen ist, wurden zur Verbesserung der Wasserl{\"o}slichkeit pharmazeutisch-technische Methoden angewandt sowie chemische Strukturmodifikationen vorgenommen: Es wurde eine Lipid-basierte, selbstemulgierende Formulierung entwickelt. Durch Ausbildung stabiler Emulsionen war 33 bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml im W{\"a}ssrigen l{\"o}slich und somit f{\"u}r die In-vivo-Untersuchung zug{\"a}nglich. Nach 4-t{\"a}giger peroraler Behandlung von NMRI-M{\"a}usen mit einer w{\"a}ssrigen 1:1-Verd{\"u}nnung der Formulierung konnte keine In-vivo-Aktivit{\"a}t festgestellt werden. Die Spr{\"u}htrocknung von 33 resultierte in amorpher Modifikation, welche in Gegenwart von PVP bzw. Eudragit®L100 stabilisiert wurde. Beide Partikel erm{\"o}glichten die {\"U}bers{\"a}ttigung von 33 im W{\"a}ssrigen, was im Fall der Eudragit®L100-Partikel zu 200-facher L{\"o}slichkeitssteigerung gegen{\"u}ber der kristallinen Wirkstoffmodifikation f{\"u}hrte und somit die In-vivo-Untersuchung erm{\"o}glichte. Zusammen mit ersten Metabolismus-Untersuchungen von 33, welche die Berechnung einer Abbau-Kinetik bzw. Clearance erm{\"o}glichte, konnte mittels der Software Simcyp® ein Plasmakonzentrationsprofil der Verbindung 33 (Eudragit®L100-Partikel) erstellt werden. Basierend auf diesem Studiendesign wurde die In-vivo-Untersuchung von 33 an mit T. b. rhodesiense infizierten M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt und zeigte nach 8-t{\"a}giger Behandlung einen deutlichen R{\"u}ckgang der Parasit{\"a}mie. Im Fokus der chemischen Strukturmodifikation stand das Einf{\"u}hren polarer und ionisierbarer Strukturelemente, um 4-Chinolon-3-carboxamid-Derivate mit erh{\"o}hter Hydrophilie (logP 1 - 3) bzw. Salz- und Co-Kristall-Strukturen zu erhalten. S{\"a}mtliche Strukturvariationen trugen zur Verbesserung der Wasserl{\"o}slichkeit und der „drug-like" Eigenschaften im Vergleich zu Verbindung 33 bei, waren allerdings von Aktivit{\"a}tsverlusten gegen{\"u}ber T. b. brucei begleitet. Anhand der „ligand efficiency"- und „lipophilic ligand efficiency"-Analyse wurden schließlich die vielversprechendsten Derivate (94 und 96) f{\"u}r die weitere Untersuchung ausgew{\"a}hlt. Mit IC50 (T. b. rhodesiense)-Werten von 4 nM (94) und 33 nM (96) und geringer Zytotoxizit{\"a}t wurden Selektivit{\"a}tsindizes bis zu 25000 gefunden, welche jene von 33 {\"u}bertrafen. Aufgrund einer L{\"o}slichkeit im millimolaren Bereich, einer moderaten Membranpermeabilit{\"a}t und einer Plasmastabilit{\"a}t von > 2 h k{\"o}nnen die Verbindungen 94 und 96 somit als erste Wirkstoffkandidaten angesehen werden. Die vollst{\"a}ndige physiko-chemische Charakterisierung wurde mittels eines Sirius-T3-Titrationssystems durchgef{\"u}hrt. Unter Verwendung dieser Parameter wurden f{\"u}r die Derivate 94 und 96 je zwei Plasmakonzentrationsprofile mit der Software Simcyp® simuliert. Basierend auf diesem Studiendesign wurde jeweils die hohe Dosis beider Derivate im Mausmodel (T. b. rhodesiense) untersucht. W{\"a}hrend nach 5-t{\"a}giger Behandlung mit 94 und 96 bei s{\"a}mtlichen Tiere keine Parasiten mehr nachweisbar waren, wurde ein leichter R{\"u}ckfall in beiden Versuchsgruppen an Tag 8 beobachtet. Gegenw{\"a}rtig wird die Behandlung mit beiden Derivaten fortgesetzt.}, subject = {Trypanosomiase}, language = {de} } @phdthesis{Buback2012, author = {Buback, Verena Simone [geb. Schulz]}, title = {Synthese neuer Cystein-Protease-Inhibitoren sowie deren theoretische und experimentelle Untersuchung hinsichtlich der Struktur-Wirkungs-Beziehung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72306}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Derivate von Vinylsulfonen (VS), die zur Klasse der Michael-Akzeptoren geh{\"o}ren, haben sich in den letzten Jahren als potente irreversible Inhibitoren von Cystein-Proteasen etabliert. Durch einen nucleophilen Angriff des Cys-Restes im aktiven Zentrum der Protease auf das beta-Kohlenstoffatom der C-C-Doppelbindung wird die Protease irreversibel alkyliert. Ziel dieser Arbeit war es, einfache theoretische und experimentelle Methoden zu entwickeln, um erste Schlussfolgerungen hinsichtlich der Reaktivit{\"a}t unterschiedlicher Vinylsulfone ziehen zu k{\"o}nnen, die zur vollst{\"a}ndigen Aufkl{\"a}rung der Struktur-Wirkungsbeziehung von Vinylsulfonen mit diversen Cystein-Proteasen dienen. Im ersten Teil der Arbeit wurden quantenmechanische Rechnungen an kleinen Vinylsulfon-Bausteinen angestellt, um den Einfluss unterschiedlicher Substitutionsmuster an der Sulfoneinheit auf die Reaktionskinetik von Vinylsulfonen zu untersuchen. Anhand der jeweiligen Potentialfl{\"a}chen ließen sich die charakteristischen Punkte der Reaktion, wie der Reaktionskomplex, der {\"U}bergangszustand (transition state, TS) sowie das Produkt mitsamt ihren Energien und Geometrien bestimmen. Die H{\"o}he der Energiebarriere, die zum Erreichen des TS {\"u}berwunden werden muss, die sogenannte Aktiverungsenergie, h{\"a}ngt {\"u}ber die Arrhenius-Gleichung mit den kinetischen Parametern der Reaktion zusammen. Es l{\"a}sst sich also durch die Kenntnis der Aktivierungsenergien die Reaktivit{\"a}tsreihenfolge unterschiedlich substituierter Vinylsulfone VS vorhersagen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Vinylsulfonbausteine synthetisiert und an separat hergestellte Peptide gekuppelt, sodass potentielle Inhibitoren erhalten wurden. So konnten u.a. die peptidischen Inhibitoren Mu-D-Phe-L-HomoPhe-VS-Me und MP-D-Phe-L-HomoPhe-VS-Me hergestellt werden. Ein zweites Syntheseprojekt besch{\"a}ftigte sich mit der Kupplung von Peptiden an neue Derivate der trans-Aziridin-2,3-dicarbons{\"a}ure. Die synthetisierten Inhibitoren waren Z-Phe-Ala-Azi, Boc-Leu-Pro-Azi und Z-Pro-Leu-Azi. Hierf{\"u}r wurden die Peptide des Vinylsulfonsprojekts in umgekehrter Aminos{\"a}ure-Reihenfolge synthetisiert, um sie an die Aziridinbausteine kuppeln zu k{\"o}nnen. Der dritte Teil der Doktorarbeit befasste sich mit der experimentellen Untersuchung der synthetisierten Vinylsulfonbausteine sowie den erhaltenen peptidischen VS- und Aziridin-basierten Inhibitoren. Es wurden einerseits Enzym-Assays durchgef{\"u}hrt, um die prozentuale Hemmung verschiedener Cystein-Proteasen durch die synthetisierten Molek{\"u}le zu messen. Keine der Verbindungen wies jedoch eine signifikannte Hemmung der Proteasen Rhodesain, Falcipain 2 und Cathepsin B auf. Andererseits wurden Modellsysteme entwickelt, um die Kinetik der Reaktionen der Vinylsulfon- und Aziridinbausteine mit einem geeigneten Thiol als Enzym-Imitat zu verfolgen. Ein zielf{\"u}hrendes Modell konnte mit Phenylethanthiol in deuteriertem Methanol realisiert werden. Durch Zusatz von NaOH, KOH oder KOtBu konnte zus{\"a}tzlich die Reaktion mit dem Thiolat untersucht werden. Die Reaktionen wurden sowohl mit IR- als auch NMR-Spektroskopie verfolgt und es wurden die Geschwindigkeitskonstanten 2. Ordnung bestimmt. Auf den ersten Blick konnte mit dem theoretischen Modell der experimentell gefundene Trend nicht vorhergesagt werden. Die Reihenfolge der Sulfonderivate aber, die an der Sulfongruppe ein weiteres Heteroatom tragen, Sulfonester und Sulfonamid, wurde richtig abgesch{\"a}tzt. Der Unterschied in der Aktivierungsenergie zwischen den Sulfonestern bel{\"a}uft sich auf 0.7 kcal pro mol. {\"U}ber die Arrheniusgleichung, ergibt sich bei Annahme desselben Arrhenius-Faktors bei einer Temperatur von 25°C, dass OPhVS um einen Faktor 3 schneller als OMeVS reagieren sollte. Tats{\"a}chlich wurde im Experiment ein Faktor von 2.6 gefunden. Aufgrund der unterschiedlichen Substituenten am Stickstoffatom, ist das Amid nicht vollst{\"a}ndig mit seinem H-substituierten theoretischen Pendant vergleichbar. Dass das Sulfonamid langsamer als die Sulfonester reagieren, wurde vom theoretischen Modell ebenfalls richtig vorhergesagt.}, subject = {Cysteinproteasen}, language = {de} } @phdthesis{Welker2013, author = {Welker, Armin}, title = {Theoretische und experimentelle Wirkstoffsuche an den Zielproteinen SARS-Coronavirus-Papain-like-Protease und Elongin-C}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72500}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Um Wirkstoffe gegen das SARS-Coronavirus zu erhalten, wurden in dieser Arbeit Proteaseinhibitoren gegen die SARS-CoV-PLpro entwickelt. Ein Ansatz um neue Wirkstoffe gegen HIV zu finden, wurde {\"u}ber eine versuchte Blockade von Elongin-C beschritten. Bei der computergest{\"u}tzten Suche nach neuen SARS-CoV-PLpro-Inihibitoren wurde zun{\"a}chst die strukturell bekannte Ligand-Bindetasche analysiert, und nach Evaluation des Dockingprozesses wurden mehrere Screeningprojekte an den R{\"o}ntgenkristallstrukturen 3E9S und 3MJ5 durchgef{\"u}hrt. Von 24 kommerziell erworbenen Screening-Verbindungen riefen 7 eine St{\"o}rung des beim Enzymassay gemessenen Fluoreszenzsignals hervor (Quenching bzw. Eigenfluoreszenz). Letztlich konnte den beiden inhibitorisch aktiven Imidazolderivaten B6 und B9 je ein IC50-Wert von etwa 50 µM zugewiesen werden. Das Imidazolscaffold er{\"o}ffnet damit eine neue Substanzklasse zur Inhibition der SARS-CoV-PLpro. Im pr{\"a}parativ-chemischen Teil des SARS-Projekts wurden weitere Substanzklassen dargestellt, von denen die Inhibitoren vom Benzamid-Typ und Isoindolin-Typ eine Hemmung im einstelligen Mikromolaren Bereich (IC50) zeigten. Die Isoindolin-Derivate sind damit eine weitere, in dieser Arbeit entwickelte Leitstruktur zur Hemmung der SARS-CoV-PLpro. Bei der Suche nach einem Wirkstoff gegen HIV-1 wurde die neue Zielstruktur Elongin-C zur Inhibition durch niedermolekulare Liganden ausgew{\"a}hlt. Vier virtuelle Screeningprojekte f{\"u}hrten zur Bestellung von 27 Verbindungen. Die durchgef{\"u}hrten Untersuchungen lassen noch keine abschließende Beurteilung der Ergebnisse zu, und der bisherige Zellassay wird noch durch spezifischere Methoden zur Bestimmung einer Ligandbindung an Elongin-C erg{\"a}nzt werden. Falls es gelingt, einer der Verbindungen Elongin-C-blockierende Aktivit{\"a}t nachzuweisen, sind aufgrund des Eingriffs in einen zellul{\"a}ren Mechanismus neben der anti-HIV-Wirkung noch weitere pharmakologische Effekte denkbar, und das therapeutische Potenzial eines solchen Stoffs k{\"o}nnte in zuk{\"u}nftigen Experimenten erforscht werden.}, subject = {Proteaseinhibitor}, language = {de} }