@phdthesis{Pfeuffer2000,
  author    = {Pfeuffer, Thilo},
  title     = {Interaktion des Proteins ActA von Listeria monocytogenes mit dem Wirtszellprotein LaXp180},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1859},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Listeria monocytogenes, ein fakultativ intrazellul{\"a}rer Krankheitserreger, besitzt die F{\"a}higkeit, Wirtszellen zu penetrieren, sich in ihnen zu vermehren, sich intrazellul{\"a}r zu bewegen und auch benachbarte Zellen direkt zu infizieren. Die intrazellul{\"a}re Fortbewegung erfolgt durch Polymerisation von zellul{\"a}rem Aktin, wodurch charakteristische Aktinschweife an einem Pol der Bakterien entstehen. Der einzige bakterielle Faktor, der f{\"u}r die Aktinpolymerisation notwendig ist, ist das Oberfl{\"a}chenprotein ActA. ActA allein ist aber nicht in der Lage, Aktin zu polymerisieren, sondern kann dies nur in Assoziation mit Proteinen der Wirtszelle. Die einzigen bisher bekannten Wirtszellproteine, die direkt mit ActA interagieren, sind das Phosphoprotein VASP und der Arp2/3-Komplex. VASP bindet an den zentralen prolinreichen Bereich von ActA und beschleunigt durch die Rekrutierung von Profilin den Prozeß der Aktinpolymerisation. Der Arp2/3-Komplex interagiert mit dem N-terminalen Bereich von ActA und initiiert die eigentliche Aktin-Polymerisation. Um weitere eukaryotische, mit ActA interagierende Proteine (AIPs) zu isolieren, wurde {\"u}ber einen "Yeast Two-Hybrid"-Test mit ActA als K{\"o}der eine embryonale Maus-cDNA-Genbank getestet. Dabei wurden drei verschiedene AIPs identifiziert, von denen eines identisch mit dem humanen Protein LaXp180 (auch "CC1" genannt) ist. LaXp180 ist ein 180 kDa Protein mit {\"u}ber 50 theoretischen Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen H{\"a}lfte, w{\"a}hrend die C-terminale H{\"a}lfte "coiled-coil"-Strukturen ausbilden kann. Dar{\"u}berhinaus enth{\"a}lt LaXp180 eine Kern-Lokalisations-Sequenz und ein Leucin-Zipper-Motiv. Die Bindung von LaXp180 an ActA wurde in vitro unter Verwendung von rekombinantem His6-Tag-LaXp180 und rekombinantem ActA best{\"a}tigt, da rekombinantes ActA nur an einer Ni-Agarose-S{\"a}ule gebunden wurde, wenn diese vorher mit His6-Tag-LaXp180 beladen war. {\"U}ber RT-PCR konnte zum ersten Mal die Expression LaXp180-spezifischer mRNA in verschiedenen S{\"a}ugerzellen nachgewiesen und mit einem polyklonalen anti-LaXp180-Serum durch Immunopr{\"a}zipitation erstmals ein 194 kDa großes Protein in S{\"a}ugerzellextrakten detektiert werden. Die intrazellul{\"a}re Lokalisation von LaXp180 wurde {\"u}ber Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Immunfluoreszenzf{\"a}rbungen von Fibroblasten mit dem anti-LaXp180-Serum zeigten eine starke F{\"a}rbung der Zellkerne und definierter Bereiche direkt neben den Kernen, w{\"a}hrend das restliche Zytoplasma schwach gef{\"a}rbt war. {\"U}ber Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem anti-LaXp180-Serum an mit L. monocytogenes infizierten Zellen konnte gezeigt werden, daß LaXp180 mit der Oberfl{\"a}che vieler, aber nicht aller intrazellul{\"a}rer, ActA-exprimierender Listerien kolokalisiert. Dagegen wurde nie eine Kolokalisation mit intrazellul{\"a}ren, aber ActA-defizienten Mutanten beobachtet. Dar{\"u}berhinaus ist LaXp180 asymmetrisch auf der Bakterienoberfl{\"a}che verteilt und schließt sich gegenseitig mit der F-Aktin-Polymerisation aus. LaXp180 ist ein putativer Bindungspartner von Stathmin, einem 19 kDa Phosphoprotein, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert. {\"U}ber Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß auch Stathmin mit intrazellul{\"a}ren, ActA-exprimierenden L. monocytogenes kolokalisiert.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nesper2000,
  author    = {Nesper, Jutta M.},
  title     = {Charakterisierung von spontan phagenresistenten Vibrio cholerae O1 El Tor Mutanten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberfl{\"a}chenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zus{\"a}tzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Molek{\"u}le synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unver{\"a}ndertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgew{\"a}hlte spontan phagenresistente St{\"a}mme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen St{\"a}mme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit ver{\"a}ndertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das f{\"u}r die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich f{\"u}r die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber ver{\"a}ndertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeintr{\"a}chtigt waren. Zus{\"a}tzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zus{\"a}tzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Ph{\"a}notyp an abiotischen Oberfl{\"a}chen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose f{\"u}r die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen M{\"a}usen ergaben, daß O-Antigen negative St{\"a}mme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im D{\"u}nndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte f{\"u}r den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zus{\"a}tzlich wurde die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen D{\"u}nndarm vorkommen, unter „in vitro" Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegen{\"u}ber schwachen organischen S{\"a}uren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallens{\"a}uren. O-Antigen negative St{\"a}mme waren dagegen weiterhin resistent gegen{\"u}ber Gallens{\"a}uren und schwachen organischen S{\"a}uren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde f{\"u}r keine der LPS-Mutanten eine gr{\"o}ßere Beeintr{\"a}chtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilit{\"a}t, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der {\"a}ußeren Membran war offensichtlich nicht beeintr{\"a}chtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verst{\"a}rktem Maße periplasmatische Proteine in den {\"U}berstand diffundieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur f{\"u}r eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund daf{\"u}r ist h{\"o}chstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen {\"a}ußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des D{\"u}nndarms erm{\"o}glicht.},
  subject      = {Vibrio cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Greiffenberg2000,
  author    = {Greiffenberg, Lars},
  title     = {Interaktion von Listeria monocytogenes mit Endothelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1340},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Listeria monocytogenes {\"u}berwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszul{\"o}sen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere k{\"o}nnte {\"u}ber die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskul{\"a}re Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die f{\"u}r die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskul{\"a}ren Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskul{\"a}ren HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen k{\"o}nnen. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC {\"u}ber einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und {\"u}ber eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das gr{\"u}n-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC {\"u}ber einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund abl{\"o}sen oder lysieren und somit gegen{\"u}ber intrazellul{\"a}ren Listerien sehr widerstandsf{\"a}hig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adh{\"a}rieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausst{\"u}lpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausst{\"u}lpungen sind mit der Zelle nur noch {\"u}ber sehr d{\"u}nne Membranschl{\"a}uche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivit{\"a}t in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberfl{\"a}chenproteinen InlA, InlB und ActA unabh{\"a}ngigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches f{\"u}r den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate betr{\"a}chtlich. Listerienst{\"a}mme mit einer Deletion im f{\"u}r InlB kodierenden Gen sind unf{\"a}hig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adh{\"a}sion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabh{\"a}ngig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. W{\"a}hrend sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erh{\"o}hen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivit{\"a}t von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zell{\"u}berstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. W{\"a}hrend eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegen{\"u}berliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dietrich2000,
  author    = {Dietrich, Claudia},
  title     = {Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle f{\"u}r die Virulenz von Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila, der Erreger der Legion{\"a}rskrankheit, ist ein fakultativ intrazellul{\"a}res, ubiquit{\"a}r vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilit{\"a}t der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen k{\"o}nnen, ist bisher noch nicht gekl{\"a}rt. Um etwas {\"u}ber noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region n{\"a}her charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst k{\"u}rzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide"-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen best{\"a}tigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adh{\"a}renz, Invasion, intrazellul{\"a}rer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle f{\"u}r das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilit{\"a}tsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gew{\"a}hlten Versuchsbedingungen bez{\"u}glich des Adh{\"a}renzverm{\"o}gens der St{\"a}mme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz f{\"u}r die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgepr{\"a}gt. Hinsichtlich der intrazellul{\"a}ren Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings f{\"u}hrte vermutlich die Reduktion der Invasivit{\"a}t zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream"-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp {\"u}berlappend, das Gen motB an, welches f{\"u}r den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen best{\"a}tigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilit{\"a}t an Vorg{\"a}ngen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adh{\"a}renz und die intrazellul{\"a}re Vermehrung nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst k{\"u}rzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream" auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabh{\"a}ngig reguliert werden.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}