@phdthesis{Kretzschmar2008, author = {Kretzschmar, Benedikt}, title = {AZT-Resistenz bei Foamyviren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30272}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), der bei HIV-Infektionen in Kombination mit anderen antiretroviralen Substanzen eingesetzt wird. AZT zeigt dar{\"u}berhinaus auch eine gute Wirksamkeit gegen Foamyviren, eine Subfamilie der Retroviren mit charakteristischen Besonderheiten in ihrer Molekularbiologie und ihrem Replikationszyklus, deren Vertreter verschiedene Affenarten und andere S{\"a}ugetiere infizieren, wobei sie sich sowohl im jeweils nat{\"u}rlichen Wirt als auch bei seltener zuf{\"a}lliger Infektion des Menschen apathogen zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das AZT-resistente Foamyvirus SFVmacAZTres untersucht, das in Anwesenheit steigender AZT-Konzentrationen in Zellkultur selektiert worden war. Hierzu wurde SFVmacAZTres zun{\"a}chst einer genotypischen Analyse unterzogen, wobei im Vergleich mit der wildtypischen Ausgangssequenz zwei Mutationen in gag und vier Mutationen in pol nachgewiesen wurden, die zu {\"A}nderungen auf Aminos{\"a}ureebene f{\"u}hrten. Mittels PCR wurden Fragmente, die alle sechs Mutationen oder nur die vier pol-Mutationen enthielten, aus der Sequenz von SFVmacAZTres amplifiziert und jeweils in einen SFVmac-Klon eingef{\"u}gt. Im weiteren Verlauf zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen diesen beiden Konstrukten bez{\"u}glich der Replikation in Abwesenheit oder Anwesenheit von AZT, so dass gefolgert werden konnte, dass die gag-Mutationen keinen Beitrag zur AZT-Resistenz leisten. Die pol-Mutationen befanden sich s{\"a}mtlich im f{\"u}r die Reverse Transkriptase kodierenden Bereich und f{\"u}hrten zu den Aminos{\"a}uresubstitutionen K211I, I224T, S345T und E350K. An Position 224 fand sich dabei in einer ver{\"o}ffentlichten Sequenz bereits ein Threonin, so dass hier unabh{\"a}ngig von der Selektion in Anwesenheit von AZT m{\"o}glicherweise ein Polymorphismus vorliegt. Der Vergleich der vier Mutationen der RT von SFVmacAZTres mit den bei HIV bekannten Mustern an Mutationen wie den TAMs und dem Q151M-Komplex zeigte keine {\"U}bereinstimmungen. Um den jeweiligen Beitrag der vier nachgewiesenen pol-Mutationen zur AZT-Resistenz zu untersuchen, wurden sie einzeln und in Kombinationen mittels zielgerichteter Mutagenese in einen SFVmac-Klon eingef{\"u}gt und die entsprechenden Konstrukte auf ihre Replikation in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,5 µM, 5µM und 50 µM AZT untersucht. Hierf{\"u}r wurden 293T-Zellen mit dem jeweiligen Plasmid transfiziert und nach {\"U}berpr{\"u}fung der gleichm{\"a}ßigen Expression von Gag und Pol mittels Western Blot der virushaltige {\"U}berstand auf Zielzellen gegeben und der Titer ausgez{\"a}hlt. Es konnte gezeigt werden, dass keines der Konstrukte mit Einzel , Doppel- und Dreifachmutationen eine {\"a}hnlich ausgepr{\"a}gte AZT-Resistenz wie die Vierfachmutante aufwies, allerdings einige in unterschiedlichen Ausmaß teilresistent waren, w{\"a}hrend andere weder ohne noch mit AZT gut replizierten. S345T erwies sich vor E350K als die Mutation mit dem gr{\"o}ßten Beitrag zur AZT-Resistenz, I224T erh{\"o}hte den Titer in Abwesenheit und Anwesenheit um etwa den gleichen Faktor, wohingegen sich K211I in den meisten Kombinationen eher negativ auswirkte. Der Klon, in den alle vier Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese eingef{\"u}hrt worden waren, zeigte die gleiche AZT-Resistenz wie das in Zellkultur selektierte Virus. Damit war gezeigt, dass diese vier Mutationen sowohl notwendig als auch hinreichend f{\"u}r die AZT-Resistenz von SFVmacAZTres sind. Die pol-Mutationen von SFVmacAZTres wurden weiterhin soweit m{\"o}glich an entsprechenden Stellen in Klon des prototypischen Foamyvirus PFV eingef{\"u}hrt, bei dem es zuvor nicht gelungen war, ein resistentes Isolat in Zellkultur zu generieren. Das PFV-Konstrukt mit den Mutationen aus SFVmacAZTres zeigte sich jedoch nicht AZT-resistent, sondern wies einen Replikationsdefekt auf. Einige HIV-Mutationen, die in den PFV-Klon eingef{\"u}gt wurden, f{\"u}hrten ebenfalls zu keiner AZT-Resistenz. Es bestehen also bez{\"u}glich AZT-Resistenz und damit gewisser Eigenschaften der Reversen Transkriptase deutliche Unterschiede zwischen PFV und SFVmac. Die durchgef{\"u}hrten Arbeiten stellen die Grundlage f{\"u}r weitere Untersuchungen dar, in denen beispielsweise dem biochemischen Mechanismus der AZT-Resistenz von SFVmacAZTres nachgegangen werden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse k{\"o}nnen zum Verst{\"a}ndnis allgemeiner Mechanismen der NRTI-Resistenz bei Retroviren ebenso beitragen wie zur weiteren Charakterisierung der foamyviralen Reversen Transkriptase an sich.}, subject = {Spumaviren}, language = {de} } @phdthesis{Plochmann2011, author = {Plochmann, Kathrin}, title = {Bioassays zur Untersuchung der biologischen Aktivit{\"a}t von Flavonoiden und Ermittlung eines zellul{\"a}ren Rezeptormolek{\"u}ls von foamyviralen Vektoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65183}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Aufgrund ihrer gut dokumentierten, umfangreichen gesundheitsf{\"o}rdernden biologischen Aktivit{\"a}ten wird den Flavonoiden eine große Bedeutung zugeordnet. Die Ergebnisse von in vitro- und Tierstudien deuten zudem darauf hin, dass diese Verbindungen bei der Pr{\"a}vention und Therapie von Erkrankungen wie Krebs oder Alzheimer Krankheit (AD) positive Effekte zeigen. Zur besseren Charakterisierung der Interaktion von Flavonoiden mit Krebszellen wurden von uns die Cytotoxizit{\"a}t verschiedener Flavonoide auf T-Lymphoblastomzellen untersucht und Strukturelemente identifiziert, welche f{\"u}r einen Flavonoid-induzierten Zelltod relevant sind. Weitere Studien waren der potentiell neuroprotektiven Wirkung von Flavonoiden gewidmet. Die sowohl in neuronalen Zellkulturen als auch in transgenen Alzheimer-M{\"a}usen (TgAPPsw) festgestellte Erh{\"o}hung der sAPPα Produktion und Reduktion von Aβ-Bildung wurden mit Aktivit{\"a}ts- und Expressionssteigerung der α-Sekretase ADAM-10 assoziiert. Um herauszufinden, ob Flavonoide eine neuroprotektive Wirkung zeigen, wurden erste Vorbereitungen f{\"u}r ein Flavonoid-Screening mit einer sowohl hAPP alsauch ADAM-10 stabil transfizierten HT1080 Zellen getroffen. Dies beinhaltete die Suche nach einer potenten siRNA/shRNA und einem effektiven Flavonoid. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Experimente durchgef{\"u}hrt, um die Rolle von Heparansulfat (HS) bei der foamyviralen Anbindung an die Wirtszelle zu untersuchen. Foamyviren (FV) sind Spumaviren und geh{\"o}ren zur Familie der Retroviren. Bei unseren Studien wurde die Bindung von FV an Heparin, die Korrelation der Suszeptibilit{\"a}t verschiedener Zellen mit zellul{\"a}rem HS und die Reduktion der Infektion durch l{\"o}sliches Heparin sowie durch enzymatischen HS-Abbau festgestellt.}, subject = {Flavonoide}, language = {de} } @phdthesis{Thuemer2009, author = {Th{\"u}mer, Leonore}, title = {Charakterisierung eines Foamyvirus-Isolats des Klammeraffens - SFVspm - aus der Neuen Welt}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48942}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Foamyviren geh{\"o}ren zur Familie der Retroviren und sind in vielen verschiedenen Primaten-Spezies pr{\"a}valent. Auch einzelne Foamyvirus-Infektionen des Menschen sind nach engem Kontakt zu Primaten beschrieben worden. Untersuchungen auf molekularer Ebene lagen bisher nur f{\"u}r Foamyviren der Altweltaffen vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die komplette Nukleotidsequenz des Neuweltaffen-Foamyvirus des Klammeraffens (SFVspm) entschl{\"u}sselt und molekular charakterisiert. DNA wurde aus SFVspm infizierten Zellen isoliert. Ausgehend von einem 425 bp langen bekannten Abschnitt des Integrase-Gens wurde das foamyvirale Genom mithilfe der Polymerasekettenreaktion in f{\"u}nf Abschnitten amplifiziert. Die Primer wurden anhand konservierter Sequenzen im SFV-Genom generiert. Die Genomabschnitte des 5'-Endes bis zum Integrase-Gen von SFVspm wurden in Plasmidvektoren kloniert und anschließend sequenziert, die Genomabschnitte vom Integrase-Gen zum 3'-Ende wurden direkt nach der PCR-Amplifikation sequenziert. Die Sequenzen der einzelnen SFVspm-Fragmente wurden zu einem zusammenh{\"a}ngenden Genom zusammengesetzt, wobei die Consensus-Sequenz aus mindestens drei unabh{\"a}ngigen Sequenzierungen pro Nukleotid ermittelt wurde. Anhand von Homologie-Vergleichen konnte das SFVspm mit einer Gr{\"o}ße von 12212 bp als komplexes Retrovirus der Unterfamilie der Spumaretrovirinae identifiziert werden. Es besitzt alle konservierten Protein-Domainen, die charakteristisch f{\"u}r Primaten-Foamyviren sind. SFVspm stellt somit das erste vollst{\"a}ndig sequenzierte und molekulargenetisch charakterisierte Neuweltaffen-FV dar. Zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zum Nachweis einer SFVspm-Infektion wurde ein 765 bp langer Abschnitt des gag-Gens als Antigen exprimiert und ein Antik{\"o}rper im Kaninchen-Serum generiert. In einem Western Blot zeigte sich f{\"u}r eine Detektion von SFVspm-Gag-Antigen bzw. Anti-SFVspm-Gag eine gute Spezifit{\"a}t und Sensitivit{\"a}t. Die auf Western Blot basierte Methodik wurde schließlich in Kombination mit einer PCR des Integrase-Gens zum Nachweis einer Infektion mit Neuweltaffen-Foamyvirus in Callithrix spp. angewandt. Es wurden Seren und Lymphozyten-DNA zw{\"o}lf verschiedener Callithrix-Affen, sowie Gewebeproben aus Milz, Leber und Mundschleimhaut untersucht, wobei in keinem Tier eine SFV-Infektion nachgewiesen werden konnte. Da Foamyviren aufgrund ihrer genetischen Stabilit{\"a}t interessante Marker f{\"u}r phylogenetische Untersuchungen sind, wurden anhand der Kenntnis der Genomsequenz von SFVspm und f{\"u}nf Altweltaffen-FV phylogenetische Stammb{\"a}ume basierend auf Nukleotid- und Aminos{\"a}uresequenzen und der Maximum-Likelihood-Methode gezeichnet und SFVspm evolution{\"a}r eingeordnet. SFVspm zeigte sich als das evolution{\"a}r divergenteste Foamyvirus aus der Teilordnung der Primaten-Foamyviren. Dies spiegelt die phylogenetische Auftrennung ihrer Wirte, der Altweltaffen und Neuweltaffen, wider und bekr{\"a}ftigt eine gemeinsame Evolution von Foamyviren und ihren Wirten.}, subject = {Foamyviren}, language = {de} } @phdthesis{Wiktorowicz2009, author = {Wiktorowicz, Tatiana}, title = {Herstellung eines neuen foamyviralen Vektors durch Einengung der cis-aktiven Sequenzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40008}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Im Vergleich zu anderen Retroviren, zeichnen sich Foamyviren durch eine Reihe von Eigenschaften aus, die sie besonders attraktiv f{\"u}r die Vektorentwicklung und somatische Gentherapie machen. Foamyviren exprimieren ihr Pol Prekursorprotein unabh{\"a}ngig von Gag, d.h. von ihrer eigenen gespleisten mRNA. Zwar ist der genaue Pol-Verpackungsmechanismus von Foamyviren noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt, fr{\"u}here Studien zeigten jedoch, dass die pr{\"a}genomische RNA essentiell f{\"u}r die Pol-Enkapsidierung ist. Zwei Pol-Verpackungssequenzen (PES) wurden identifiziert, welche sich in den cis-aktiven Sequenzen (CAS) der pr{\"a}genomischen RNA befinden (Heinkelein et al., 1998; Peters et al., 2005). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die PESI und PESII Sequenzen alleine ausreichend f{\"u}r die Pol-Verpackung sind. Zus{\"a}tzich wurde der Einfluss von verschiedenen Teilen der ca. 2000 nt langen CASII Sequenz auf den Vektortransfer ohne Verlust der Pol-Enkapsidierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PESI und PESII alleine nicht ausreichend f{\"u}r die Pol-Verpackung ins foamyvirale Partikel sind. Die Verk{\"u}rzung des CASII Elements zeigte keinen Effekt auf die Pol-Verpackung und den Vektortransfer. Das Einf{\"u}gen eines zus{\"a}tzlichen zentralen Polypurintraktes f{\"u}hrte jedoch zur signifikanten Erh{\"o}hung der Transduktionseffizienz von FV Vektoren. Diese Ergebnisse f{\"u}hrten zur Entwicklung eines neuen foamyviralen Vektors (pTW01), der ca. 850nt k{\"u}rzer ist als die fr{\"u}her etablierten FV Vektoren, aber immer noch die gleiche Transduktionseffizienz auf Fibroblasten und humanen Stammzellen zeigt. Dieser Vektor mit einer h{\"o}heren Verpackungskapazit{\"a}t und Sicherheit, eignet sich hervorragend f{\"u}r den Einsatz in gentherapeutischen Studien. Zus{\"a}tzlich konnte gezeigt werden, dass eine heterologe Verpackung zwischen zwei unterschiedlichen Foamyviren (PFV und SFVmac) zu einem geringen Prozentsatz stattfindet. Als erster Schritt in der Entwickung eines neues Systems f{\"u}r eine einfache und kosteng{\"u}nstige Vektorvirusproduktion wurde gezeigt, dass die Expression der foamyviralen Gag, Pol und Env Proteine in Saccharomyces cerevisiae stattfinden kann.}, subject = {Gentheraphie}, language = {de} } @phdthesis{Pietschmann2000, author = {Pietschmann, Thomas}, title = {Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion des H{\"u}llproteins des Humanen Foamyvirus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1879}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale H{\"u}llproteine wie das Env Protein des murinen Leuk{\"a}mievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesikl{\"a}ren Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV H{\"u}llproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu {\"u}bernehmen. Offenbar werden f{\"u}r die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen H{\"u}llprotein ben{\"o}tigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Dom{\"a}ne des HFV H{\"u}llproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erf{\"u}llt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung {\"u}bernommen werden k{\"o}nnen. Die Analyse der Fusionsaktivit{\"a}t verschiedener H{\"u}llproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Dom{\"a}ne des Proteins nicht essentiell f{\"u}r die Fusionsaktivit{\"a}t ben{\"o}tigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Dom{\"a}ne des Proteins einschlossen, f{\"u}hrten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des H{\"u}llproteins. Innerhalb der membranspannenden Dom{\"a}ne des HFV H{\"u}llproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellul{\"a}ren Transport und auf die Fusionsaktivit{\"a}t des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Dom{\"a}ne des HFV H{\"u}llproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zus{\"a}tzlich f{\"u}r verschiedene Funktionen des H{\"u}llproteins von Bedeutung ist.}, subject = {Spumaviren}, language = {de} } @phdthesis{PicardMaureau2003, author = {Picard-Maureau, Marcus}, title = {Molekulare Analyse der Penetration von Foamyviren und Konstruktion und Charakterisierung von Adenovirus-Foamyvirus Hybridvektoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5445}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Ber{\"u}cksichtung des FV H{\"u}llglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. {\"U}ber die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umh{\"u}llte Viren k{\"o}nnen entweder durch direkte Fusion der viralen H{\"u}lle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abh{\"a}ngigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellul{\"a}rer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abh{\"a}ngigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. {\"A}hnlich wie bei Vesikul{\"a}res Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen l{\"a}sst. Eine Analyse der pH-Abh{\"a}ngigkeit der FV Env Fusionsaktivit{\"a}t in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivit{\"a}t mit einer maximalen St{\"a}rke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivit{\"a}t bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivit{\"a}t in saurem Milieu weist auf eine Konformations{\"a}nderung des H{\"u}llglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abh{\"a}ngigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazit{\"a}ts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verst{\"a}rktes Gr{\"u}n Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Prim{\"a}rinfektion {\"u}ber einen intrazellul{\"a}ren Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die {\"u}ber einen Se-kund{\"a}rzyklus mit Hilfe extrazellul{\"a}rer Partikel stabil transduzieren k{\"o}nnen, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herk{\"o}mmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant h{\"o}here persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erh{\"o}hte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten.}, subject = {Spumaviren}, language = {de} }