@phdthesis{Porps2008,
  author    = {Porps, Patrick},
  title     = {Erh{\"o}hte Lebenserwartung und Resistenz gegen{\"u}ber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36171},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {{\"U}bertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod f{\"u}hren. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infekti{\"o}se Agens „Prion" teilweise oder vollst{\"a}ndig aus dem zellul{\"a}ren Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine m{\"o}gliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Hom{\"o}ostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrP\&\#916;32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Dom{\"a}ne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20\% erh{\"o}hte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Ver{\"a}nderungen f{\"u}hrte, wurde die Lebensspanne um 8\% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizit{\"a}t der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion {\"u}bergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabh{\"a}ngigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anf{\"a}lligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizit{\"a}t der Deletionsmutante {\"u}bergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bez{\"u}glich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Dom{\"a}ne, durch die m{\"o}glicherweise Fenton-{\"a}hnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden k{\"o}nnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung {\"u}ber einen bislang unaufgekl{\"a}rten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die M{\"o}glichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner erm{\"o}glicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzukl{\"a}ren.},
  subject      = {Prion},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hoffmann2008,
  author    = {Hoffmann, Tanja},
  title     = {Herstellung und Charakterisierung von Antik{\"o}rpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellul{\"a}ren Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infekti{\"o}se Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc {\"u}bernimmt. Die Konversion des zellul{\"a}ren Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten m{\"o}gliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antik{\"o}rper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen k{\"o}nnen und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antik{\"o}rper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen k{\"o}nnen und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antik{\"o}rpern f{\"u}r therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antik{\"o}rper mittels „Hybridom"-Technik hergestellt. Zwei der Antik{\"o}rper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-M{\"a}usen, die zuvor mit fibrill{\"a}rem PrP immunisiert wurden. Bei f{\"u}nf Antik{\"o}rpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde f{\"u}r die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antik{\"o}rper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Avidit{\"a}ten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantik{\"o}rpern vergleichbar. Das Epitop des Antik{\"o}rpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), w{\"a}hrend die Antik{\"o}rper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globul{\"a}ren C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antik{\"o}rper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antik{\"o}rper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits h{\"a}ufiger f{\"u}r inhibitorisch wirksame Antik{\"o}rper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antik{\"o}rper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antik{\"o}rper 48-11-5 f{\"u}hrte zu einer unvollst{\"a}ndigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verl{\"a}ngerung des Applikationszeitraums nicht verst{\"a}rken ließ. Dagegen inhibierten die Antik{\"o}rper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollst{\"a}ndig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antik{\"o}rper mit PrP zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch h{\"a}tte verringern k{\"o}nnen, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosit{\"a}t von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antik{\"o}rper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosit{\"a}t der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antik{\"o}rper 103-8 reduzierte die Infektiosit{\"a}t der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antik{\"o}rper B2-43-133 die Infektiosit{\"a}t der ScN2a-Zellen vollst{\"a}ndig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antik{\"o}rper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antik{\"o}rpers wird zus{\"a}tzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterst{\"u}tzt, der mit kommerziellen Referenzantik{\"o}rpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse daf{\"u}r, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antik{\"o}rpern der Antik{\"o}rper B2-43-133 ein Kandidat f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antik{\"o}rper f{\"u}r die Inhibition nutzen, konnte nicht gekl{\"a}rt werden. Obwohl der Antik{\"o}rper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfl{\"a}che (Retention) verl{\"a}ngerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Molek{\"u}le der PrPSc-Konversion entzogen werden k{\"o}nnen, wurde dies f{\"u}r einen Referenzantik{\"o}rper, welcher einen {\"a}hnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder daf{\"u}r, dass die Verl{\"a}ngerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antik{\"o}rper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder daf{\"u}r, dass verschiedene Antik{\"o}rper verschiedene Mechanismen nutzen k{\"o}nnen. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antik{\"o}rpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht best{\"a}tigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antik{\"o}rpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erh{\"o}hung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antik{\"o}rper f{\"u}hrte.},
  subject      = {Monoklonaler Antik{\"o}rper},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nitschke2006,
  author    = {Nitschke, Cindy},
  title     = {Humorale und zellul{\"a}re Immunantwort gegen das Prion-Protein},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18409},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von {\"u}bertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie f{\"u}r Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantik{\"o}rpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zellul{\"a}re Prion-Protein beschrieben und die zellul{\"a}ren und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-M{\"a}usen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten M{\"a}usen spezifische Antik{\"o}rper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erh{\"o}hte Zytokinspiegel von TNF\&\#61537; und IFN\&\#61543; induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antik{\"o}rperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypm{\"a}usen nachgewiesen werden. Die induzierten Antik{\"o}rper in Wildtypm{\"a}usen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgef{\"u}hrt. Hierf{\"u}r wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zus{\"a}tzlich zum PrP f{\"u}r das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in fr{\"u}heren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen k{\"o}rpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antik{\"o}rperantwort in Prnp0/0-M{\"a}usen induziert werden konnte. In Wildtypm{\"a}usen wurden allerdings nur geringe Antik{\"o}rpertiter nachgewiesen. Die Antik{\"o}rper aus den Prnp0/0-M{\"a}usen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-M{\"a}usen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 st{\"a}rker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypm{\"a}usen eine unspezifische Erh{\"o}hung der Zytokinantwort mit erh{\"o}hten TNF\&\#61537;- und IFN\&\#61543;-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgef{\"u}hrt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypm{\"a}use mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle M{\"a}use aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und f{\"u}r Prionenerkrankungen typische histopathologische Ver{\"a}nderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren.},
  subject      = {Prion},
  language  = {de}
}