@phdthesis{Herrmann2009,
  author    = {Herrmann, Petra},
  title     = {Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37500},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen k{\"o}nnen im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, n{\"a}mlich die {\"U}berlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im {\"U}berschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit {\"u}berwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellul{\"a}r gewachsene Bakterien {\"u}ber Bindung an paramagnetische Partikel („Beads") und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gew{\"a}hlt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel \&\#61483; Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy - CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur f{\"u}r die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate f{\"u}r die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien w{\"a}hrend der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. F{\"u}r einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen" Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begr{\"u}ndet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen F{\"a}llen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellul{\"a}ren Ver{\"a}nderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten {\"u}bereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazellul{\"a}re posttranskriptionelle Mechanismen begr{\"u}ndet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Halscheidt2007,
  author    = {Halscheidt, Anja},
  title     = {Das RpoS-Protein aus Vibrio cholerae : Funktionsanalyse und Charakterisierung der Proteolyse-Kaskade},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27325},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde zun{\"a}chst die Konservierung bekannter RpoS-assoziierter Funktionen f{\"u}r das V. cholerae Homolog untersucht. Dabei ergab die ph{\"a}notypische Analyse der rpoS-Deletionsmutante, dass analog zu der Bedeutung als Regulator des Station{\"a}rphasen-Wachstums in E. coli, definierte Zelldichte-abh{\"a}ngige Eigenschaften in V. cholerae gleichermaßen der Kontrolle von RpoS unterliegen. In weiterf{\"u}hrenden Experimenten konnte daraufhin die Konservierung der entsprechenden Promotorstrukturen {\"u}ber die funktionelle Komplementierung rpoS-abh{\"a}ngiger Gene durch das jeweils speziesfremde Protein aufgedeckt werden. Dahingegen konnte die Bedeutung von RpoS bei der Auspr{\"a}gung der generellen Stress-Resistenz u. a. in E. coli f{\"u}r das V. cholerae Homolog {\"u}ber den gew{\"a}hlten experimentellen Ansatz nicht belegt werden. So wurden in Survival-Assays f{\"u}r keine der getesteten Stress-Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen rpoS-Mutante und Wildtyp ermittelt. Die in E. coli gezeigte intrazellul{\"a}re Anreicherung des Sigmafaktors unter diversen Stress-Situationen konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Hinsichtlich der potentiellen Stellung von RpoS als globaler Regulator f{\"u}r Virulenz-assoziierte Gene, unterst{\"u}tzen und erg{\"a}nzen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gegenw{\"a}rtige Theorie, wonach RpoS das Abl{\"o}sen der V. cholerae Zellen vom Darm-Epithel f{\"o}rdert. Die postulierte Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in der letzten Phase der Pathogenese wurde {\"u}ber die RpoS-abh{\"a}ngige Sekretion der Mukin-degradierenden Protease HapA und die hier unabh{\"a}ngig nachgewiesene Transkriptionskontrolle von Chemotaxis-Genen best{\"a}tigt. In E. coli gilt als entscheidender Parameter f{\"u}r die dargelegten RpoS-Funktionen die intrazellul{\"a}re Konzentration des Masterregulators. Deshalb war ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit die Regulation des RpoS-Levels in V. cholerae. Neben der Identifizierung von Bedingungen, welche die RpoS-Expression beeinflussen, wurde vorrangig der Mechanismus der Proteolyse analysiert. Dabei wurden als RpoS-degradierende Komponenten in V. cholerae die Homologe des Proteolyse-Targetingfaktors RssB und des Protease-Komplexes ClpXP identifiziert. Die weitere Untersuchung der RpoS-Proteolyse ergab außerdem, dass bestimmte Stress-Signale den Abbau stark verz{\"o}gern. Interessanterweise resultierten die gleichen Signale jedoch nicht in der Akkumulation von RpoS. Als weiterer Unterschied zu der bekannten Proteolysekaskade in E. coli zeigte sich, dass das V. cholerae Homolog der RssB-aktivierenden Kinase ArcB (FexB) an der RpoS-Proteolyse nicht beteiligt ist. Indessen deuten die Ergebnisse weiterf{\"u}hrender Experimente auf den Einfluss der Kinasen CheA-1 und CheA-3 des V. cholerae Chemotaxis-Systems auf die RpoS-Degradation. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zu E. coli abweichendes Modell der RpoS-Proteolyse postuliert, in welchem die aktiven CheA-Kinasen den Targetingfaktor RssB phosphorylieren und somit den Abbau einleiten. Die Beteiligung von MCP-Rezeptoren an der Kontrolle der intrazellul{\"a}ren RpoS-Konzentration und damit an der Transkription der Chemotaxisgene selbst, beschreibt erstmalig ein Regulationssystem, wonach innerhalb der Chemotaxis-Kaskade die Rezeptoraktivit{\"a}t wahrscheinlich {\"u}ber einen positiven „Feedback-Loop" mit der eigenen Gen-Expression gekoppelt ist. Dar{\"u}ber hinaus deutete sich die Beteiligung der ATP-abh{\"a}ngigen Protease Lon an der RpoS-Proteolyse-Kaskade in V. cholerae an. Die Inaktivierung der in E. coli unter Hitzeschock-Bedingungen induzierten Protease resultierte in einem extrem beschleunigten RpoS-Abbau. Ein letztes Teilprojekt dieser Arbeit adressierte die Regulationsmechanismen der V. cholerae Osmostress-Adaptation. W{\"a}hrend in E. coli der alternative Sigmafaktor dabei eine zentrale Rolle spielt, konnte die Beteiligung des V. cholerae RpoS an der Osmostress-Regulation jedoch nicht aufgedeckt werden. Daf{\"u}r ergab die Funktionsanalyse eines neu definierten Osmostress-Sensors (OsmRK) die Kontrolle von ompU durch dieses Zwei-Komponentensystems unter hypertonen Bedingungen. Dieses Ergebnis {\"u}berraschte, da bislang nur der Virulenzfaktor ToxR als Regulator f{\"u}r das Außenmembranporin beschrieben wurde. Die nachgewiesene ompU-Transkriptionskontrolle durch zwei Regulatoren f{\"u}hrte zu der Hypothese eines unbekannten regulativen Netzwerkes, welchem mindestens 52 weitere Gene zugeordnet werden konnten. Insgesamt ist festzuhalten, dass die in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrte molekulare Charakterisierung der RpoS-Proteolyse in V. cholerae Beweise f{\"u}r eine m{\"o}gliche Verbindung zwischen der Transkriptionskontrolle f{\"u}r Motilit{\"a}ts- und Chemotaxisgene mit der Chemotaxis-Reizwahrnehmung erbrachte. Eine derartige intermolekulare Verkn{\"u}pfung wurde bislang f{\"u}r keinen anderen Organismus beschrieben und stellt somit eine neue Variante der Signaltransduktion innerhalb der Virulenz-assoziierten Genregulation dar.},
  subject      = {V. cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Michel2005,
  author    = {Michel, Antje},
  title     = {Molekularbiologische Untersuchungen zur Eignung Virulenz-relevanter Faktoren als Zielstrukturen f{\"u}r die Entwicklung neuer Antibiotika gegen Staphylococcus aureus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15128},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus-St{\"a}mmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika k{\"o}nnen zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. G{\"a}ngige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen f{\"u}r die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre {\"U}berlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu {\"u}berpr{\"u}fen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden ph{\"a}notypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenit{\"a}t in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die \&\#8710;clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeintr{\"a}chtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte h{\"a}molytische Aktivit{\"a}t sowie eine verminderte Adh{\"a}renz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erh{\"o}hte autolytische Aktivit{\"a}t in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erh{\"o}hte Invasivit{\"a}t im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der \&\#8710;clpP-Mutante durch Einf{\"u}hrung eines clpP-Expressionsvektors f{\"u}hrte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Ph{\"a}notyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Ver{\"a}nderung in der Genexpression (15 \% aller Gene). Eine computerunterst{\"u}tzte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene f{\"u}hrte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivit{\"a}t in Abh{\"a}ngigkeit zu ver{\"a}nderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten f{\"u}hrte zu einer gesteigerten h{\"a}molytischen Aktivit{\"a}t, einer erh{\"o}hten Adh{\"a}renz an Polystyren sowie einer erh{\"o}hten autolytischen Aktivit{\"a}t in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der station{\"a}ren Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 \% und in der station{\"a}ren Phase 15 \% der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Ver{\"a}nderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder h{\"a}molytischen Aktivit{\"a}t auf. In einem Infektionsmodell in Ratten f{\"u}hrte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis f{\"u}r den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war f{\"u}r eine eindeutige Kl{\"a}rung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeintr{\"a}chtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt.},
  subject      = {Staphylococcus aureus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schild2005,
  author    = {Schild, Stefan},
  title     = {Bedeutung der Lipopolysaccharidstrukturen bei pathogenen Vibrio cholerae St{\"a}mmen f{\"u}r die Ausbildung von Cholera und Abgrenzung zu Umweltisolaten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12989},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Obwohl inzwischen {\"u}ber 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbr{\"u}che der Cholera haupts{\"a}chlich von St{\"a}mmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor n{\"a}her zu untersuchen, wurden Adh{\"a}sionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgef{\"u}hrt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte f{\"u}r eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85\%, f{\"u}r eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70\% in der Adh{\"a}sionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls m{\"o}glich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erh{\"o}hte Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur f{\"u}r die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schl{\"u}sselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberfl{\"a}chenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Prim{\"a}rstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivit{\"a}t beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abh{\"a}ngig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivit{\"a}t einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verf{\"u}gung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS f{\"u}r eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifit{\"a}t der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivit{\"a}t der Galaktosyltransferase WavM, essentiell f{\"u}r die Aktivit{\"a}t der Gal-abh{\"a}ngigen Ligase von V194. Die Gal-unabh{\"a}ngige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdom{\"a}ne f{\"u}r Gal in der C-terminalen H{\"a}lfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminos{\"a}uren (AS) in verschiedenen Ligasen f{\"u}hrte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven f{\"u}hrte zum Verlust der Ligase-Aktivi{\"a}t von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach m{\"o}glichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. {\"U}ber die Anpassungen von V. cholerae an aquatische {\"O}kosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarit{\"a}t, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher f{\"u}r eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erkl{\"a}rung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen f{\"u}hrt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erh{\"o}hten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. W{\"a}hrend die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, f{\"u}hrte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt.},
  subject      = {Vibrio cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klug2003,
  author    = {Klug, Michael},
  title     = {Phasenvariation bei Legionella pneumophila: Vergleichende Proteomanalyse von virulenten und avirulenten Legionella pneumophila-St{\"a}mmen unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7464},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die St{\"a}mme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich ph{\"a}notypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfl{\"a}che, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nesper2000,
  author    = {Nesper, Jutta M.},
  title     = {Charakterisierung von spontan phagenresistenten Vibrio cholerae O1 El Tor Mutanten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberfl{\"a}chenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zus{\"a}tzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Molek{\"u}le synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unver{\"a}ndertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgew{\"a}hlte spontan phagenresistente St{\"a}mme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen St{\"a}mme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit ver{\"a}ndertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das f{\"u}r die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich f{\"u}r die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber ver{\"a}ndertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeintr{\"a}chtigt waren. Zus{\"a}tzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zus{\"a}tzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Ph{\"a}notyp an abiotischen Oberfl{\"a}chen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose f{\"u}r die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen M{\"a}usen ergaben, daß O-Antigen negative St{\"a}mme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im D{\"u}nndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte f{\"u}r den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zus{\"a}tzlich wurde die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen D{\"u}nndarm vorkommen, unter „in vitro" Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegen{\"u}ber schwachen organischen S{\"a}uren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallens{\"a}uren. O-Antigen negative St{\"a}mme waren dagegen weiterhin resistent gegen{\"u}ber Gallens{\"a}uren und schwachen organischen S{\"a}uren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde f{\"u}r keine der LPS-Mutanten eine gr{\"o}ßere Beeintr{\"a}chtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilit{\"a}t, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der {\"a}ußeren Membran war offensichtlich nicht beeintr{\"a}chtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verst{\"a}rktem Maße periplasmatische Proteine in den {\"U}berstand diffundieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur f{\"u}r eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund daf{\"u}r ist h{\"o}chstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen {\"a}ußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des D{\"u}nndarms erm{\"o}glicht.},
  subject      = {Vibrio cholerae},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Dietrich2000,
  author    = {Dietrich, Claudia},
  title     = {Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle f{\"u}r die Virulenz von Legionella pneumophila},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Legionella pneumophila, der Erreger der Legion{\"a}rskrankheit, ist ein fakultativ intrazellul{\"a}res, ubiquit{\"a}r vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilit{\"a}t der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen k{\"o}nnen, ist bisher noch nicht gekl{\"a}rt. Um etwas {\"u}ber noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region n{\"a}her charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst k{\"u}rzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide"-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen best{\"a}tigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adh{\"a}renz, Invasion, intrazellul{\"a}rer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle f{\"u}r das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilit{\"a}tsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gew{\"a}hlten Versuchsbedingungen bez{\"u}glich des Adh{\"a}renzverm{\"o}gens der St{\"a}mme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz f{\"u}r die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgepr{\"a}gt. Hinsichtlich der intrazellul{\"a}ren Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings f{\"u}hrte vermutlich die Reduktion der Invasivit{\"a}t zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream"-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp {\"u}berlappend, das Gen motB an, welches f{\"u}r den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen best{\"a}tigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilit{\"a}t an Vorg{\"a}ngen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adh{\"a}renz und die intrazellul{\"a}re Vermehrung nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst k{\"u}rzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream" auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabh{\"a}ngig reguliert werden.},
  subject      = {Legionella pneumophila},
  language  = {de}
}