@phdthesis{Horntrich2014,
  author    = {Horntrich, Claudia},
  title     = {Die Funktion von Membranlipidnanodom{\"a}nen f{\"u}r Signaltransduktionsprozesse in Pflanzen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107362},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {In vielen tierischen Zellen und in Hefe wurden Membrandom{\"a}nen als Plattformen f{\"u}r die Etablierung von Signalkomplexen bereits gut beschrieben (Foster et al., 2003) und entsprechend ihrer Resistenz gegen{\"u}ber nicht-ionischen Detergenzien charakterisiert (Shogomori et al., 2003). Die Behandlung von Membranen mit solchen Detergenzien kann zu Artefakten f{\"u}hren und die Anwesenheit eines Proteins in diesen so genannten „DRMs" bedeutet noch nicht, dass es auch in nativen Membrandom{\"a}nen lokalisiert ist. Allerdings muss man sich, mangels besserer Methoden zur Aufreinigung von Membrandom{\"a}nen, heute noch der Methode der DRM-Aufreinigung durch Detergenzien bedienen, um eine erste Vorstellung von der Proteinzusammensetzung dieser bestimmten Membranbereiche zu erhalten. Mittels Sterolreduktion der DRMs durch die Behandlung der isolierten Membranfraktionen mit MCD und anschließender HPLC-ESI-Massenspektrometrie, konnten 80 Proteine identifiziert werden, die somit als potentiell in Membrandom{\"a}nen lokalisiert gelten k{\"o}nnen. Unter diesen befanden sich die beiden Arabidopsis-Remorine AtRem1.2 und AtRem1.3, die Ca2+-abh{\"a}ngige Proteinkinase CPK21 und die Proteinphosphatase 2C ABI1. Dieses Phosphatase-Kinase-Paar reguliert den membranst{\"a}ndigen, im Mesophyll exprimierten, Anionenkanal SLAH3 in ABA-abh{\"a}ngiger Weise (Geiger et al., 2011). Mit Hilfe biochemischer, massenspektrometrischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die Phosphatase ABI1 in Abwesenheit von ABA die Interaktion zwischen der Kinase CPK21 und dem Anionenkanal SLAH3 unterbindet. Dies geschieht indem SLAH3 und CPK21 aus den Membrandom{\"a}nen in die umgebenden Membranbereiche verlagert werden und somit eine phosphorylierungsabh{\"a}ngige Aktivierung des Anionenkanals verhindert wird (Demir et al., 2013). Unter den in Nanodom{\"a}nen lokalisiert Proteinen, konnte auch die NADPH-Oxidase AtrbohD als schwach sterolabh{\"a}ngig identifiziert werden. Diese zeigte im Gegensatz zu der homologen Oxidase AtrbohF, nach transienter Koexpression in Arabidopsis-Epidermiszellen zwar eine Lokalisation in distinkten Membrandom{\"a}nen, aber keine Kolokalisation mit dem zuvor etablierten Membrandom{\"a}nenmarker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). Dieses Ergebnis impliziert, dass es verschiedene Arten von Membrandom{\"a}nen geben k{\"o}nnte und dass die beiden Oxidasen (zumindest zeitweise) in unterschiedlichen Membrankompartimenten lokalisiert und dadurch wom{\"o}glich auch unterschiedlich reguliert sein k{\"o}nnen. Nach Koexpression der Oxidase AtrbohD mit den weiteren 12 der insgesamt 16 Arabidopsis-Remorinen, konnte eine Kolokalisation der Oxidase mit AtRem1.4 best{\"a}tigt werden. Das Remorin AtRem1.4 zeigt in weiteren Versuchen nicht nur eine deutliche Lokalisierung in anderen sterolreichen Membrandom{\"a}nen als AtRem1.3, es zeigt auch eine eindeutige laterale Immobilit{\"a}t und kann somit als ein Marker f{\"u}r Membrandom{\"a}nen etabliert werden. Somit best{\"a}tigt sich die Annahme, dass es auch in Pflanzen unterschiedliche Arten von Membrankompartimenten gibt. Zu diesem Zeitpunkt war noch kein, die Funktion der Oxidase regulierender Interaktionspartner von AtrbohD bekannt, um die Frage des Zusammenhangs zwischen Lokalisation und Funktion der Oxidase beantworten zu k{\"o}nnen. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Techniken (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, konnte aus einer Auswahl von f{\"u}nf Mesophyll-lokalisierten und Ca2+-unabh{\"a}ngigen Snrk2-Kinasen, zwei potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Genau wie mit der homologen Oxidase AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), interagiert die ABA-abh{\"a}ngige Kinase OST1/Snrk2.6 auch mit AtrbohD. Bei dem zweiten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um Snrk2.7. Die Behandlung der transfizierten und in den Interaktionsmessungen eingesetzten Zellen mit der sterolreduzierenden Reagenz MCD resultierte in einem signifikanten Anstieg der zuvor gemessenen Interaktionseffizienzen (EFRET) aller f{\"u}nf ausgew{\"a}hlten Snrk2-Kinasen mit AtrbohD. Eine Interaktion zwischen zwei Proteinen muss nicht zwingend bedeuten, dass sie eine funktionelle Einheit in einem Signalweg darstellen. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der identifizierten potentiellen Interaktionspartner auf die ROS-Produktionsaktivit{\"a}t der NADPH-Oxidase AtrbohD untersucht. Es zeigt sich, dass Snrk2.7 die ROS-Produktion durch die Oxidase auf ein vergleichbar hohes Niveau steigern kann, wie die zu diesem Zeitpunkt als Interaktionspartner der Oxidase AtrbohD identifizierte Ca2+-abh{\"a}ngige Kinase CPK5 (Dubiella et al., 2013). Die Kinase Snrk2.7 interagiert also nicht nur mit AtrbohD, sondern kann die Oxidase auch phosphorylieren (wahrscheinlich an einer der beiden f{\"u}r die Phosphorylierung von AtrbohD als essentiell beschriebenen Positionen S343 oder S347 (N{\"u}hse et al., 2007) und nicht an der untersuchten Position S39) und somit aktivieren. Dem hingegen zeigt OST1, trotz einer zuvor best{\"a}tigten Interaktion mit AtrbohD, nicht die F{\"a}higkeit diese Oxidase auch aktivieren zu k{\"o}nnen. Die Snrk2.7-vermittelte Aktivit{\"a}t von AtrbohD ist ebenfalls deutlich durch eine Behandlung der transfizierten Zellen mit MCD induzierbar. Die NADPH-Oxidase AtrbohD wird also in Abh{\"a}ngigkeit ihrer Lokalisierung in spezifischen Membrandom{\"a}nen reguliert. Wenn die zwei essentiellen Phosphorylierungsstellen durch eine Punktmutation ausgeschaltet werden und die Oxidase nicht mehr als Antwort auf Pathogene aktiviert werden kann, lokalisiert diese nicht mehr in den AtRem1.4-markierten Membrandom{\"a}nen. Auch zeigt sich, dass die Aktivit{\"a}t der Oxidase, induziert durch eine Interaktion mit der nicht in Membrandom{\"a}nen lokalisierten Snrk2-Kinase Snrk2.7, gesteigert werden kann, wenn durch MCD die sterolreichen Membrandom{\"a}nen abgereichert werden. Eventuell dienen Membrandom{\"a}nen, zumindest im pflanzlichen System, nicht nur der Etablierung von Signalkomplexen, sondern in einigen F{\"a}llen auch der Negativregulierung von bestimmten Proteinaktivit{\"a}ten, wie zum Beispiel in diesem Fall, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}