@phdthesis{Zimmermann2012,
  author    = {Zimmermann, Melanie Andrea},
  title     = {Charakterisierung und Expressionsanalysen von H{\"a}mophilie-A-Mutationen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85747},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Bei einem kleinen Prozentsatz (2-3 \%) aller molekulargenetisch untersuchten H{\"a}-mophilie-A-F{\"a}lle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der H{\"a}mophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zus{\"a}tzlicher Methoden aufgekl{\"a}rt werden. Bei zwei Patienten mit milder H{\"a}mophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalit{\"a}t dieser Austausche zu {\"u}berpr{\"u}fen, wurden f{\"u}r diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgef{\"u}hrt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivit{\"a}t des Promotors deutlich herabsetzen und daher als urs{\"a}chlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die {\"u}brigen Patienten auf epigenetische Ver{\"a}nderungen in f{\"u}nf CpG-Inseln im 5'UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auff{\"a}llige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Ver{\"a}nderungen im Intron 1 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen k{\"o}nnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalit{\"a}t der Mutationen gekl{\"a}rt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 \%) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) {\"u}berein, w{\"a}hrend es bei 22 \% der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten H{\"a}mophilie-A-Patienten aufgekl{\"a}rt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen f{\"u}hren k{\"o}nnen und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter N{\"a}he der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen H{\"a}mophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer H{\"a}mophilie A aufgefallen, welche ungew{\"o}hnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auff{\"a}lligen Bandenmuster nicht erkl{\"a}ren konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass f{\"u}nf der untersuchten F{\"a}lle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellul{\"a}ren Expressionssystem durchgef{\"u}hrt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Dom{\"a}nen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Dom{\"a}nen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazellul{\"a}re Immunlokalisation der trunkierten Proteine best{\"a}tigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Dom{\"a}ne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen erm{\"o}glicht und das FVIII-Protein vor Degradation sch{\"u}tzt.},
  subject      = {H{\"a}mophilie},
  language  = {de}
}