@phdthesis{Bach2007,
  author    = {Bach, Patricia},
  title     = {Immunogenicity of antigen-displaying virus-like particles and their use as a potential vaccine against prion diseases},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25889},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a group of infectious neurodegenerative diseases that are associated with misfolding of the cellular form of the cellular prion protein (PrPC) into a disease associated conformer (PrPSc). No therapy for prion diseases is available at present. So far, anti-PrPC vaccination is hampered by immunological tolerance of the mammalian immune system to endogenous PrPC. The aim of this thesis was to set up a new vaccination strategy based on virus-like particles (VLP) to induce anti-PrPC antibody responses in PrPC-competent mice. In a first step it was assessed whether VLP have the capacity to induce antibody responses that are protective against conventional pathogens. For this purpose, VLP displaying the vesicular stomatitis virus-gylcoprotein (VLP-VSV) were generated and tested for their immunogenicity. Similarly to live vesicular stomatitis virus (VSV), replication deficient VLP-VSV induced T help-independent VSV neutralizing IgM responses that switched to the IgG subclass in a T help-dependent manner. Furthermore, type I IFN receptor (IFNAR) triggering only marginally affected VLP-VSV induced neutralizing IgM responses, whereas it was critically required to promote the IgG switch. The analysis of conditional knockout mice with a lymphocyte-specific IFNAR deletion revealed that IFNAR triggering of lymphocytes did not play a crucial role, neither upon VLP-VSV nor VSV immunization. Collectively, these data verified the high immunogenicity of VLP. Therefore, in a next step VLP were generated displaying the C-terminal half of PrP (residues 121-231aa) fused to the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) transmembrane region (VLP-PrPD111) for anti-PrPC immunization. On the surface of such retroparticles, PrPC was expressed at high levels as determined by electron microscopy. VLP-PrPD111 immunization of Prnp-deficient (Prnp0/0) mice resulted in antibody response specifically binding the cellular form of PrPC. Upon intravenous injection of wild-type mice, high PrPC-specific IgM responses were induced, whereas the T cell-dependent switch from the IgM to the IgG subclass was less pronounced. As a consequence, anti-PrPC titers were rather short-lived. The impaired subclass switch was probably related with host T cell tolerance to endogenous PrPC. Attempts to increase anti-PrPC IgG responses in wild-type mice via administration of VLP-PrPD111 emulsified in various different adjuvants failed. Nevertheless, in single individuals low IgG antibodies were induced after immunization of VLP-PrPD111 emulsified in CFA. To circumvent T cell tolerance in wild-type mice, a multitude of different immunization strategies was tested, including priming and boosting protocols with different types of VLP or VLP expressing PrPC together with foreign T helper epitopes. Overall, those efforts did not improve anti-PrPC IgG responses in wild-type mice. Interestingly, anti-PrPC antibodies induced in Prnp0/0 mice reduced PrPSc levels in prion infected cell cultures, whereas serum of vaccinated wild-type mice did not. To assess the protective capacity of VLP-PrPD111 induced immune responses, vaccinated wild-type mice were infected with scrapie (RML 5.0). Unfortunately, vaccinated mice did not show a significant delay in the onset of scrapie. In a last part of the thesis it was studied whether in the absence of T cell help activated "memory" B cells were able to produce anti-PrPC specific antibodies. To address this question, PrPC-specific memory B cells were sorted from vaccinated Prnp0/0 mice and adoptively transferred into wild-type recipient mice. Upon VLP-PrPD111 challenge, no PrPC-specific IgG titers were induced in the recipients. Nevertheless, several VLP-PrPD111 challenged recipient mice were protected against scrapie infection. In conclusion, VLP were characterized as highly immunogenic vaccines that were used to elucidate various questions concerning adaptive immune response and basic mechanisms of PrPC-specific tolerance vs. immunity. Remarkably, VLP-PrPD111 was able to induce native PrPC-specific antibodies in wild-type mice but major difficulties associated with PrPC-specific tolerance made efficacious scrapie vaccination impossible. New vaccination approaches are being tested to overcome these limitations.},
  subject      = {Prion},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hoffmann2008,
  author    = {Hoffmann, Tanja},
  title     = {Herstellung und Charakterisierung von Antik{\"o}rpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellul{\"a}ren Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infekti{\"o}se Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc {\"u}bernimmt. Die Konversion des zellul{\"a}ren Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten m{\"o}gliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antik{\"o}rper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen k{\"o}nnen und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antik{\"o}rper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen k{\"o}nnen und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antik{\"o}rpern f{\"u}r therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antik{\"o}rper mittels „Hybridom"-Technik hergestellt. Zwei der Antik{\"o}rper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-M{\"a}usen, die zuvor mit fibrill{\"a}rem PrP immunisiert wurden. Bei f{\"u}nf Antik{\"o}rpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde f{\"u}r die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antik{\"o}rper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Avidit{\"a}ten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantik{\"o}rpern vergleichbar. Das Epitop des Antik{\"o}rpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), w{\"a}hrend die Antik{\"o}rper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globul{\"a}ren C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antik{\"o}rper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antik{\"o}rper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits h{\"a}ufiger f{\"u}r inhibitorisch wirksame Antik{\"o}rper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antik{\"o}rper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antik{\"o}rper 48-11-5 f{\"u}hrte zu einer unvollst{\"a}ndigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verl{\"a}ngerung des Applikationszeitraums nicht verst{\"a}rken ließ. Dagegen inhibierten die Antik{\"o}rper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollst{\"a}ndig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antik{\"o}rper mit PrP zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch h{\"a}tte verringern k{\"o}nnen, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosit{\"a}t von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antik{\"o}rper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosit{\"a}t der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antik{\"o}rper 103-8 reduzierte die Infektiosit{\"a}t der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antik{\"o}rper B2-43-133 die Infektiosit{\"a}t der ScN2a-Zellen vollst{\"a}ndig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antik{\"o}rper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antik{\"o}rpers wird zus{\"a}tzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterst{\"u}tzt, der mit kommerziellen Referenzantik{\"o}rpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse daf{\"u}r, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antik{\"o}rpern der Antik{\"o}rper B2-43-133 ein Kandidat f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antik{\"o}rper f{\"u}r die Inhibition nutzen, konnte nicht gekl{\"a}rt werden. Obwohl der Antik{\"o}rper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfl{\"a}che (Retention) verl{\"a}ngerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Molek{\"u}le der PrPSc-Konversion entzogen werden k{\"o}nnen, wurde dies f{\"u}r einen Referenzantik{\"o}rper, welcher einen {\"a}hnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder daf{\"u}r, dass die Verl{\"a}ngerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antik{\"o}rper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder daf{\"u}r, dass verschiedene Antik{\"o}rper verschiedene Mechanismen nutzen k{\"o}nnen. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antik{\"o}rpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht best{\"a}tigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antik{\"o}rpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erh{\"o}hung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antik{\"o}rper f{\"u}hrte.},
  subject      = {Monoklonaler Antik{\"o}rper},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Porps2008,
  author    = {Porps, Patrick},
  title     = {Erh{\"o}hte Lebenserwartung und Resistenz gegen{\"u}ber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36171},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {{\"U}bertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod f{\"u}hren. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infekti{\"o}se Agens „Prion" teilweise oder vollst{\"a}ndig aus dem zellul{\"a}ren Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine m{\"o}gliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Hom{\"o}ostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrP\&\#916;32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Dom{\"a}ne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20\% erh{\"o}hte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Ver{\"a}nderungen f{\"u}hrte, wurde die Lebensspanne um 8\% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizit{\"a}t der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion {\"u}bergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabh{\"a}ngigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anf{\"a}lligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizit{\"a}t der Deletionsmutante {\"u}bergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bez{\"u}glich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Dom{\"a}ne, durch die m{\"o}glicherweise Fenton-{\"a}hnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden k{\"o}nnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung {\"u}ber einen bislang unaufgekl{\"a}rten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die M{\"o}glichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner erm{\"o}glicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzukl{\"a}ren.},
  subject      = {Prion},
  language  = {de}
}