@article{BlachutzikDemirKreuzeretal.2012,
  author    = {Blachutzik, J{\"o}rg O. and Demir, Faith and Kreuzer, Ines and Hedrich, Rainer and Harms, Gregory S.},
  title     = {Methods of staining and visualization of sphingolipid enriched and non-enriched plasma membrane regions of Arabidopsis thaliana with fluorescent dyes and lipid analogues},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75433},
  year      = {2012},
  abstract  = {Background: Sterols and Sphingolipids form lipid clusters in the plasma membranes of cell types throughout the animal and plant kingdoms. These lipid domains provide a medium for protein signaling complexes at the plasma membrane and are also observed to be principal regions of membrane contact at the inception of infection. We visualized different specific fluorescent lipophilic stains of the both sphingolipid enriched and non-sphingolipid enriched regions in the plasma membranes of live protoplasts of Arabidopsis thaliana. Results: Lipid staining protocols for several fluorescent lipid analogues in plants are presented. The most emphasis was placed on successful protocols for the single and dual staining of sphingolipid enriched regions and exclusion of sphingolipid enriched regions on the plasma membrane of Arabidopsis thaliana protoplasts. A secondary focus was placed to ensure that these staining protocols presented still maintain cell viability. Furthermore, the protocols were successfully tested with the spectrally sensitive dye Laurdan. Conclusion: Almost all existing staining procedures of the plasma membrane with fluorescent lipid analogues are specified for animal cells and tissues. In order to develop lipid staining protocols for plants, procedures were established with critical steps for the plasma membrane staining of Arabidopsis leaf tissue and protoplasts. The success of the plasma membrane staining protocols was additionally verified by measurements of lipid dynamics by the fluorescence recovery after photobleaching technique and by the observation of new phenomena such as time dependent lipid polarization events in living protoplasts, for which a putative physiological relevance is suggested.},
  subject      = {Arabidopsis thaliana},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Grebner2012,
  author    = {Grebner, Wiebke},
  title     = {Organspezifische Bildung und Funktion von Oxylipinen in Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76730},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Oxylipine sind Signalmolek{\"u}le, welche durch die enzymatische oder nicht-enzymatische Oxidation von Fetts{\"a}uren gebildet werden. Eine bedeutende Gruppe von Oxylipinen in Pflanzen sind die Jasmonate. Dazu z{\"a}hlen Jasmons{\"a}ure (JA), deren Vorstufe 12-Oxophytodiens{\"a}ure (OPDA) sowie deren Metabolite. Ein bedeutender Metabolit von JA ist das Aminos{\"a}ure-Konjugat JA-Isoleucin (JA-Ile), welches hohe biologische Aktivit{\"a}t besitzt. Besonders f{\"u}r die oberirdischen Organe von Pflanzen wurden bisher vielf{\"a}ltige Funktionen von Jasmonaten beschrieben. Sie sind beteiligt an verschiedenen Entwicklungsprozessen wie der Fertilit{\"a}t von Bl{\"u}ten, aber auch an der Abwehr von Pathogenen und Herbivoren und bei der Reaktion von Pflanzen auf abiotische Stressoren wie hohe Salzkonzentrationen oder Trockenheit. {\"U}ber die Bildung und Funktion von Oxylipinen in Wurzeln ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit die Gehalte von Galaktolipiden und Jasmonaten in Spross und Wurzel von Arabidopsis thaliana Pflanzen verglichen. Mit Hilfe verschiedener JA Biosynthese-Mutanten konnte zudem die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel und deren biologische Funktion in diesem Pflanzenorgan untersucht werden. Um die Wurzeln der Arabidopsis Pflanzen einfach behandeln zu k{\"o}nnen und um schnell und stressfrei gr{\"o}ßere Mengen von Wurzelmaterial ernten zu k{\"o}nnen, wurde ein hydroponisches Anzuchtsystem etabliert. Die Analyse von Galaktolipiden zeigte, dass in der Wurzel deutlich geringere Galaktolipid Gehalte als im Spross vorhanden sind. Da Galaktolipide den Hauptbestandteil plastid{\"a}rer Membranen ausmachen, in den Wurzeln insgesamt jedoch weniger Plastiden vorkommen als in Bl{\"a}ttern, w{\"a}re dies ein m{\"o}glicher Grund f{\"u}r den beobachteten Unterschied. Das Vorkommen von mit OPDA oder dnOPDA veresterten Galaktolipiden (Arabidopsiden) wird in der Literatur f{\"u}r die Thylakoidmembranen der Chloroplasten beschrieben. Die Analyse der Arabidopsid Gehalte von Wurzeln konnte diese Aussage st{\"u}tzen, da in Wurzeln, welche normalerweise keine Chloroplasten besitzen, nahezu keine Arabidopside detektiert werden konnten. Die Analyse der Jasmonate zeigte anhand von Pfropfungsexperimenten mit der Jasmonat-freien dde2 Mutante, dass die Wurzeln unabh{\"a}ngig vom Spross in der Lage sind Jasmonate zu bilden, obwohl die Expression vieler JA-Biosynthese-Gene in den Wurzeln sehr gering ist. Zudem zeigten diese Experimente, dass es keinen direkten Transport von Jasmonaten zwischen Spross und Wurzel gibt. Die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel konnte durch verschiedene Stresse wie Verwundung, osmotischen Stress oder Trockenheit induziert werden. K{\"a}lte und Salzstress hatten hingegen keinen Jasmonat-Anstieg in den Wurzeln zur Folge. Anders als bei osmotischem Stress und Trockenheit, wo sowohl die Gehalte von OPDA als auch von JA und JA-Ile anstiegen, konnte bei Verwundung keine Zunahme der OPDA-Spiegel detektiert werden. Hier kam es zu einer deutlichen Abnahme, wohingegen die JA und JA-Ile Spiegel sehr stark anstiegen. Dies deutet darauf hin, dass es sehr komplexe und vielf{\"a}ltige Regulationsmechanismen hinsichtlich der Bildung von Jasmonaten gibt. Der erste Schritt der JA-Biosynthese, die Bildung von 13-Hydroperoxyfetts{\"a}uren (HPOTE), wird durch 13-Lipoxygenase (LOX) Enzyme katalysiert. In Arabidopsis sind vier unterschiedliche 13-LOX Isoformen bekannt. Die Untersuchung verschiedener 13-LOX-Mutanten ergab, dass nur die LOX6 an der Biosynthese von Jasmonaten in der Wurzel beteiligt ist. So konnten in Wurzeln der lox6 Mutante weder basal noch nach verschiedenen Stressen bedeutende Mengen von Jasmonaten gemessen werden. Im Spross dieser Mutante war basal kein OPDA vorhanden, nach Stresseinwirkung wurden jedoch {\"a}hnliche Jasmonat Gehalte wie im Wildtyp detektiert. Um Hinweise auf die biologische Funktion von Jasmonaten in Wurzeln zu erhalten, wurden Untersuchungen mit einer lox6 KO Mutante durchgef{\"u}hrt. Dabei zeigte sich, dass abgeschnittene lox6 Wurzeln, welche keine Jasmonate bilden, im Vergleich zum Wildtyp von saprobiont lebenden Kellerasseln (Porcellio scaber) bevorzugt als Futter genutzt werden. Bl{\"a}tter dieser Mutante, welche nach Stress ann{\"a}hernd gleiche Jasmonat Gehalte wie der Wildtyp aufweisen, wurden nicht bevorzugt gefressen. Von der Jasmonat-freien dde2 Mutante wurden hingegen sowohl die Wurzeln als auch die Bl{\"a}tter bevorzugt gefressen. Neben den Experimenten mit Kellerasseln wurden auch Welke-Versuche mit lox6 und dde2 Pflanzen durchgef{\"u}hrt. Hierbei wiesen die lox6 Pflanzen, nicht aber die dde2 Pflanzen, eine erh{\"o}hte Suszeptibilit{\"a}t gegen{\"u}ber Trockenheit auf. dde2 Pflanzen haben im Gegensatz zu LOX Mutanten unver{\"a}nderte 13-HPOTE Gehalte, aus denen auch andere Oxylipine als Jasmonate gebildet werden k{\"o}nnen. Dies zeigt, dass durch LOX6 gebildete Oxylipine, im Falle von Trockenheit aber nicht Jasmonate, an der Reaktion von Arabidopsis Pflanzen auf biotische und abiotische Stresse beteiligt sind.},
  subject      = {Oxylipine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wehner2012,
  author    = {Wehner, Nora},
  title     = {Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene f{\"u}r TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufkl{\"a}rung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen f{\"u}r Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen f{\"u}r Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als n{\"u}tzliche Ressourcen f{\"u}r genetische Analysen zur Verf{\"u}gung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden k{\"o}nnen. Ein Mikrotiterplatten-System f{\"u}r Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann {\"u}ber die Luciferaseaktivit{\"a}t bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalit{\"a}t des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie {\"u}berpr{\"u}ft, wobei bekannte Bindungsspezifit{\"a}ten der TF best{\"a}tigt werden konnten. F{\"u}r das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen f{\"u}r Screening-Ans{\"a}tze zur Verf{\"u}gung. F{\"u}r das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Dar{\"u}ber hinaus wurde gezeigt, dass es m{\"o}glich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolek{\"u}len (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ans{\"a}tzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein h{\"o}heres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekund{\"a}rmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zus{\"a}tzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-{\"U}berexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des daf{\"u}r entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue {\"U}berexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erh{\"o}hte Toleranz gegen{\"u}ber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}