@phdthesis{Uhlenhut2012,
  author    = {Uhlenhut, Klaus},
  title     = {Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72102},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Um die Grundlagen f{\"u}r die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellul{\"a}ren Ebene aufzukl{\"a}ren, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entz{\"u}ndlichen Vorg{\"a}ngen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gef{\"a}ß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Ged{\"a}chtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgef{\"u}hrten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabh{\"a}ngige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entz{\"u}ndungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enth{\"a}lt, und Hydrocortison zeigte M1 zus{\"a}tzlich einen st{\"a}rkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entz{\"u}ndungsreiz. Die Zytotoxizit{\"a}t von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalf{\"a}ngereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabh{\"a}ngiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine m{\"o}gliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, prim{\"a}ren Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise f{\"u}r eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranst{\"a}ndige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ans{\"a}tze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren {\"u}ber die Testzeitr{\"a}ume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl {\"u}ber kurze (≤ 45 min) als auch {\"u}ber l{\"a}ngere Zeitr{\"a}ume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivit{\"a}t der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabh{\"a}ngige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazellul{\"a}re NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in j{\"u}ngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universit{\"a}tsklinikum Z{\"u}rich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 w{\"o}chiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gef{\"a}ßerweiterungskapazit{\"a}t (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Ver{\"a}nderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 f{\"u}hrte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur m{\"o}glichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgew{\"a}hlten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich h{\"o}heren Verteilung ins Gehirn f{\"u}r die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechus{\"a}ure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankeng{\"a}ngig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den h{\"o}chsten logBB-Wert und somit die h{\"o}chste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu {\"u}berwinden. Im Kontext einer m{\"o}glichen Anwendung bei chronisch-entz{\"u}ndlichen Erkrankungen wurde zus{\"a}tzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem prim{\"a}ren Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entz{\"u}ndungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverd{\"u}nnungen deutliche konzentrationsabh{\"a}ngige Hemmeffekte um bis zu ~50 \% der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beitr{\"a}ge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verst{\"a}ndnis der m{\"o}glichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden.},
  subject      = {Stickstoffmonoxid},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schwiering2019,
  author    = {Schwiering, Fabian},
  title     = {Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Leberfibrose in der Maus},
  doi       = {10.25972/OPUS-18652},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-186520},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Mittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse {\"u}ber die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer {\"u}berm{\"a}ßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen f{\"u}hren kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiem{\"o}glichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung bei verschiedenen Organfibrosen kommt. Deshalb wird vermutet, dass die NO-GC eine modulatorische Rolle bei der Entwicklung einer Organfibrose einnimmt. Die Effektorzellen sind bisher unbekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten die Effektorzellen der Lunge in vitro untersucht werden. Da bekannt ist, dass in der Lunge Perizyten NO-GC exprimieren, wurde ein Protokoll etabliert, das es erm{\"o}glichte, Perizyten spezifisch aus der Lunge zu isolieren und in Kultur zu bringen. Durch den Einsatz von verschiedenen Markern wurden im Anschluss diese isolierten Perizyten weiter charakterisiert. Zum einen konnte festgestellt werden, dass die NO-GC in diesen isolierten Zellen exprimiert wird. Zum anderen stellte sich heraus, dass die Perizyten auch durch einen Marker (SM/MHC) identifiziert werden k{\"o}nnen, der eigentlich als VSMC-Marker gilt. Diese Daten waren analog zu den In-vivo-Daten von Aue et al. Zus{\"a}tzlich sollte untersucht werden, ob diese NO-GC- exprimierenden Perizyten in Kultur zu Myofibroblasten differenziert werden k{\"o}nnen. Dies gelang jedoch nicht durch Stimulation mit TGF-β1. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, in welchen Zellen in der Leber die NO-GC exprimiert wird. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die NO-GC in der Leber in den HSC exprimiert wird. Da bekannt ist, dass die NO-GC Einfluss auf die Organfibrose nimmt, sollte die NO-GC-Expression in der Leberfibrose untersucht werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass es zu einer gesteigerten NO-GC-Expression in der CCl4-induzierten Leberfibrose kommt. Diese war vor allem in den Myofibroblasten lokalisiert - den Zellen, die wahrscheinlich f{\"u}r den {\"u}berm{\"a}ßigen Einbau der EZM sorgen. Um den Einfluss der NO-GC auf die Leberfibrose genau- er zu untersuchen, wurde die Fibrose zwischen WT- und GCKO-Tieren verglichen. Dabei konnte beobachtet werden, dass es in den GCKO-Tieren zu einer st{\"a}rkeren Fibrose als in WT-Tieren kam, die sich durch eine vermehrte Einlagerung von Kollagen und einer erh{\"o}hten Expression von TGF-β1 auszeichnete. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die NO-GC eine wahrschein- lich protektive Rolle in der Leberfibrose einnimmt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HSC in der Leberfibrose genauer untersucht. Dabei konnte zum ersten mal festgestellt werden, dass sich die HSC in Subpopulation unter- teilen lassen. Durch den Einsatz von Reporterm{\"a}usen, bei denen unter dem SM/MHC- oder PDGFRβ-Promotor das Flurophor tdTomato exprimiert wurde, ließen sich die HSC in 3 Subpo- pulationen einteilen: (1) SM/MHC-Tomato- und PDGFRβ-Tomato-; (2) SM/MHC-Tomato- und PDGFRβ-Tomato+ und (3) SM/MHC-Tomato+ und PDGFRβ-Tomato-. Durch Lineage-Tracing- Versuche konnte den beschriebenen Subpopulationen Aufgaben in der Leberfibrose und in deren Aufl{\"o}sung zugeordnet werden. Die Subpopulation 1 ist in der gesunden Leber haupts{\"a}chlich in den Zonen 2 und 3 des Leberazinus lokalisiert. In der Fibrose wandern diese Zellen zu den fibrotischen Regionen und differenzieren dort zu Myofibroblasten. In der Aufl{\"o}sung der Fibrose verschwinden diese Zellen durch Apoptose aus der Leber. Die HSC-Subpopulation 2 befindet sich in der gesunden Leber in der Zone 1 des Leberazinus. Auch in und nach Aufl{\"o}sung der Leberfibrose verweilen diese Zellen dort. Zwar befindet sich die HSC-Subpopulation 3 in der ge- sunden Leber ebenfalls nur in Zone 1 des Leberazinus, jedoch wandern die Zellen in der Fibrose in die Zone 2 und 3 und ersetzen dort die HSC-Subpopulation 1, die in die fibrotische Region gewandert ist. Nach Aufl{\"o}sung der Leberfibrose hat die HSC-Subpopulation 3 die Population 1 vollst{\"a}ndig ersetzt. Nach Identifizierung der HSC-Subpopulationen stellte sich die Frage, ob ein spezifischer Aus- schnitt der NO-GC zu einer ver{\"a}nderten Leberfibrose f{\"u}hrt im Vergleich zum WT. Dazu wurde unter dem SM/MHC- und PDGFRβ-Promotor die NO-GC deletiert und die Fibrose in diesen Knockouts untersucht. W{\"a}hrend bei der Deletion der NO-GC unter dem PDGFRβ-Promotor kein Unterschied im Vergleich zum WT gesehen werden konnte, ließ sich beim SM/MHC-GCKO Unterschiede feststellen. Durch den Ausschnitt der NO-GC in den Zellen der HSC-Subpopulation 3 kam es zu einer verringerten Expression von PPARγ in der gesunden Leber. Da PPARγ als Gegenspieler von TGF-β1 fungiert, konnte eine erh{\"o}hte TGF-β1-Expression in der gesunden und fibrotischen Leber des SM/MHC-GCKO im Vergleich zum WT-Tier gesehen werden. Diese Ergebnisse sprechen daf{\"u}r, dass die NO-GC {\"u}ber die Steuerung des PPARγ ihren protektiven Effekt auf die Leberfibrose aus{\"u}bt.},
  subject      = {Leberfibrose},
  language  = {de}
}