@phdthesis{Kuss2000,
  author    = {Kuß, Andreas},
  title     = {Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus {\"u}ber den Antigenrezeptor f{\"u}hrt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation {\"u}ber CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und sch{\"u}tzt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation {\"u}ber CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in prim{\"a}ren B-Lymphozyten aus M{\"a}usen anregt. Die CD40 Abh{\"a}ngigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem f{\"u}r unreife B-Lymphozyten, best{\"a}tigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abh{\"a}ngigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden {\"u}ber chim{\"a}re Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression {\"u}ber eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen {\"u}ber den BZR wiesen diese eine gr{\"o}ßere {\"U}berlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erkl{\"a}rt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abh{\"a}ngige Aktivit{\"a}tsverlust eines NFkB-abh{\"a}ngigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die {\"U}berexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, f{\"u}hrte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsf{\"a}higkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdr{\"u}ckte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsf{\"a}higkeit aufrecht erh{\"a}lt, w{\"a}hrend die andere das {\"U}berleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach f{\"u}r letztere von zentraler Bedeutung.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hegyi2001,
  author    = {Hegyi, Annette},
  title     = {Charakterisierung der Substratspezifit{\"a}t coronaviraler 3C-like-Proteasen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-271},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Coronaviren sind mit einer Genomgr{\"o}ße von 27-32 kb die gr{\"o}ßten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und f{\"u}hren zu betr{\"a}chtlichen wirtschaftlichen Sch{\"a}den in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie f{\"u}hrt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schl{\"u}sselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmolek{\"u}le f{\"u}r die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung f{\"u}r die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifit{\"a}t der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zun{\"a}chst f{\"u}nf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Dom{\"a}ne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminos{\"a}uresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinit{\"a}tschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivit{\"a}t gegen{\"u}ber synthetischen Peptiden und konnten somit f{\"u}r die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repr{\"a}sentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die {\"u}ber Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. {\"U}bereinstimmend konnte f{\"u}r die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine fr{\"u}hzeitige (m{\"o}glicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge h{\"a}tte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repr{\"a}sentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen {\"u}beraus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage f{\"u}r die Entwicklung eines f{\"u}r Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay f{\"u}r Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verf{\"u}gbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und k{\"o}nnte in modifizierter Form auch f{\"u}r andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays f{\"u}r ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie f{\"u}r die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. F{\"u}r das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufkl{\"a}rung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifit{\"a}t. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit f{\"u}r die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften f{\"u}hrten, die gute Voraussetzungen f{\"u}r eine r{\"o}ntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen.},
  subject      = {Coronaviren},
  language  = {de}
}