@phdthesis{Schmidt2004, author = {Schmidt, Arthur}, title = {Die Interaktion der Transkriptionsfaktoren NF-ATc und GATA-3 in T-Helfer-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11664}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Interleukin-5 ist ein Th2-Cytokin, das eosinophile Granulozyten aktiviert und B-Zellen zur Produktion von IgE stimuliert. Bei der Entstehung von allergischen (wie z.B. Asthma) und atopischen Reaktionen spielt die erh{\"o}hte Aussch{\"u}ttung von IL-5 eine wichtige Rolle. Der Interleukin-5-Promoter weist unter anderem Bindestellen f{\"u}r NF-AT-Faktoren und GATA-3 auf. NF-ATc ist ein Mitglied der NF-AT („Nuclear Factor of Activated T-cells")-Transkriptionsfaktoren, die an den verschiedensten immunologischen Funktionen beteiligt sind, vor allem aber an der Steuerung der Cytokingene. GATA-3 ist ein wichtiger Th2-spezifischer Zinkfinger-Transkriptionsfaktor aus der Familie der GATA-Faktoren, die an eine gemeinsame WGATAR-Sequenz der DNA binden. Molkentin et al. zeigten 1998, daß NF-AT3 und GATA-4 in Herzmuskelzellen physikalisch interagieren und daß ihre funktionelle Kooperation bei der Aktivierung verschiedener Promotoren letztendlich zur Entwicklung einer Herzhypertrophie beitr{\"a}gt. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine {\"a}hnliche physikalische Interaktion zwischen NF-ATc und GATA-3 in T-Zellen stattfindet. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil der Arbeit Coimmunopr{\"a}zipitationen durchgef{\"u}hrt. Dabei konnte in mit NF-ATc und GATA-3 cotransfizierten 293T Zellen eine spezifische in vivo Interaktion der beiden Transkriptionsfaktoren nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten mittels GST-„pulldown"-Experimenten die f{\"u}r die Interaktion wichtigen Proteindom{\"a}nen von NF-ATc und GATA-3 bestimmt werden. Im ersten Schritt wurden die daf{\"u}r ben{\"o}tigten Plasmide konstruiert. Im zweiten Schritt erfolgte die bakterielle Expression und nachfolgende Aufreinigung der GST-Fusionsproteine. Mit GST wurde jeweils eine N- und C-terminale H{\"a}lfte von NF-ATc und GATA-3 fusioniert. Mit diesen rekombinanten Proteinen wurden die „pulldown"-Experimente durchgef{\"u}hrt. Dabei konnte eine Interaktion des C-terminalen Anteils (enth{\"a}lt den zweiten Zinkfinger) von GATA-3 mit NF-ATc detektiert werden. Nachfolgende Ergebnisse deuteten auf eine Interaktion des C-terminalen Anteils (enth{\"a}lt die „Rel-Similarity-Domain") von NF-ATc mit GATA-3 hin. Analog zeigten Molkentin et al., daß die RSD von NF-AT3 mit dem C-terminalen Zinkfinger von GATA-4 in Herzmuskelzellen interagiert. Die Interaktion von NF-ATc und GATA-3 scheint nicht nur physikalisch zu existieren, sondern auch funktionell von Bedeutung zu sein. In Luciferase-Reporteressays, die in unserem Labor durchgef{\"u}hrt wurden, zeigte sich bei Cotransfektion von NF-ATc und GATA-3 im Vergleich zu Einzeltranfektionen eine drastische Aktivit{\"a}tssteigerung des IL-5 Promoters. Diese Ergebnisse weisen - wiederum analog zu den Vorg{\"a}nge im Herzen - auf eine funktionelle Kooperation der beiden Transkriptionsfaktoren bei der Steuerung des IL-5 Promoters hin.}, language = {de} } @phdthesis{Koenig2004, author = {K{\"o}nig, Corinne}, title = {Die transkriptionelle Regulation der Proteintyrosinkinase p 56 lck als Schl{\"u}sselenzym der Thymozytenreifung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8867}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des proximalen Promotors der lymphozytenspezifischen Proteintyrosinkinase lck untersucht. Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Beteiligung der Familie der NF-AT-Transkriptionsfaktoren an der Kontrolle der Promotoraktivit{\"a}t. Es konnte zun{\"a}chst gezeigt werden, dass NF-ATs aus Zellkulturzellen sowie aus frisch isolierten Thymozyten spezifisch an Sequenzmotive in der regulatorischen Region des lck-Typ-I-Promotors binden. Die NF-AT-Bindungsstellen mit der h{\"o}chsten Affinit{\"a}t wurden in Pos. -480/-476 (NF-AT-I lck) und in Pos. -216/-212 (NF-AT-II lck) identifiziert. Eine Mutation in den Bindungsmotiven verhinderte dementsprechend die Ausbildung von NF-AT-Komplexen mit der DNA. Dar{\"u}ber hinaus wurde nachgewiesen, dass NF-AT-Faktoren den proximalen lck-Promotor allein und zusammen mit Faktoren der Ets-Familie bzw. c-Myb aktivieren k{\"o}nnen. Die Untersuchung der Interaktion von NF-AT und c-Myb ergab, dass die beiden Transkriptionsfaktoren unmittelbar benachbart an die DNA binden. Unter Ber{\"u}cksichtigung dieses Bindungsverhaltens und der Kooperation in der Transaktivierung des Promotors konnten wir somit eine neue Form eines NF-AT-"composite elements" beschreiben. Bei der Untersuchung von NF-AT-"knock out"-M{\"a}usen auf Anzeichen einer lck-Bildungsst{\"o}rung zeigte sich eine deutliche Reduktion der lck-Typ-I-Transkripte in NF-AT1/NF-AT4 doppelt defizienten Tieren. Dies belegt die Relevanz der NF-AT-Faktoren f{\"u}r die Aktivit{\"a}t des proximalen lck-Promotors in vivo.}, language = {de} }