@phdthesis{Melichar2002, author = {Melichar, Volker O.}, title = {Einfluß der Atherosklerose auf den NO:cGMP Signalweg am Modell des cholesteringef{\"u}tterten Kaninchen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3833}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Atherosklerose ist Volkskrankheit und Todesursache Nummer Eins in den sogenannten entwickelten L{\"a}ndern. Ursachen f{\"u}r die meisten Folgeerkrankungen sind Minderperfusion und Gef{\"a}ßverschluß, verursacht durch Ablagerungen und Verdickung der Gef{\"a}ßwand und durch einen pathologisch erh{\"o}hten Gef{\"a}ßtonus. Mehrere zellul{\"a}re Signalwege, die im Gesunden eine Vasodilatation hervorrufen k{\"o}nnen, sind in atherosklerotischen Gef{\"a}ßen gest{\"o}rt, so auch der NO:cGMP-Signalweg. Der Einfluß der Atherosklerose auf den NO-abh{\"a}ngigen Teil des Signalwegs, also NO-Produktion und -Abbau, sowie Diffusion von NO zu den glatten Muskelzellen, ist seit l{\"a}ngerem bekannt. In dieser Studie zeigen wir, daß im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auch der NO-unabh{\"a}ngige Teil des Signalwegs in erheblichen Maße gest{\"o}rt ist. Die Expression und Aktivit{\"a}t der Enzyme l{\"o}sliche Guanylatzyklase (sGC) und cGMP-abh{\"a}ngige Proteinkinase-I ist vor allem in der neugebildeten Neointima reduziert. P-VASP, ein Indikator der Aktivit{\"a}t des gesamten NO:cGMP-Signalwegs, ist in eindrucksvoller Weise reduziert. Die Enzyme des NO-unabh{\"a}ngigen Teils des NO:cGMP-Signalwegs werden in zunehmenden Maße pharmakologisch beeinflußbar. Die Ergebnisse dieser Studie stellen somit eine wichtige Grundlage f{\"u}r neue Therapieans{\"a}tze der Atherosklerose dar.}, language = {de} } @phdthesis{Heintel2006, author = {Heintel, Timo Michael}, title = {Einfluss von Stickstoffmonoxid auf die Genexpression humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten w{\"a}hrend Expansion und Redifferenzierung in einem in-vitro-Modell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20456}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Bei der Kultivierung humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten f{\"u}r eine m{\"o}gliche therapeutische Anwendung gilt es, deren besondere zellphysiologische Eigenschaften zu ber{\"u}cksichtigen, um ein zell- und molekularbiologisch hochwertiges Transplantat erzielen zu k{\"o}nnen. Stickstoffmonoxid (NO) gilt als ein wichtiger Faktor f{\"u}r die Hom{\"o}ostase der chondrogenen Extrazellul{\"a}rmatrix, der f{\"u}r die Funktion des hyalinen Gelenkknorpels entscheidenden Gewebekomponente. Es stellt bisherigen Untersuchungen nach einen wichtigen Regulator im sensiblen Gleichgewicht zwischen der Synthese knorpelspezifischer Matrixproteine und dem Matrixabbau dar. Trotz dieser Bedeutung ist das Wissen {\"u}ber die Expression der NO-generierenden Enzyme in humanen artikul{\"a}ren Chondrozyten, insbesondere unter Kulturbedingungen, sehr begrenzt. Des Weiteren fehlen Erkenntnisse {\"u}ber den Einfluss von NO auf den Differenzierungsstatus dieser Zellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Charakterisierung der Genexpression adulter Gelenkknorpelzellen w{\"a}hrend deren Expansion und anschließender Redifferenzierung in einem in vitro-Modell. Das Hauptaugenmerk wurde hierbei auf die 3 NOS-Isoformen sowie die beiden Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan gelegt. In Zusatzversuchen wurde die Bedeutung von NO f{\"u}r den Metabolismus sowie f{\"u}r Differenzierungsvorg{\"a}nge humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten untersucht. Hierbei sollten funktionelle Zusammenh{\"a}nge aufgezeigt und regulative Abh{\"a}ngigkeiten auf der Ebene der Transkription identifiziert werden. Humane artikul{\"a}re Chondrozyten wurden hierf{\"u}r unter standardisierten Bedingungen enzymatisch aus Knorpelgewebe von Femurk{\"o}pfen isoliert. Nach Expansion der Zellen in zweidimensionaler Monolayerkultur wurden die amplifizierten Zellen in Form dreidimensionaler Zellaggregate in einem chondrogenen Differenzierungsmedium rekultiviert. Ver{\"a}nderungen des zellul{\"a}ren Ph{\"a}notyps wurden morphologisch, histochemisch, immunhistochemisch und mittels RT-PCR auf Genexpressionsebene verfolgt. Im Verlauf der Expansion konnte eine funktionelle und morphologische Dedifferenzierung der Chondrozyten dokumentiert werden. Durch 21t{\"a}gige Rekultivierung in einem definierten chondrogenen Differenzierungsmedium konnten die Zellen ihre, zuvor verloren gegangenen knorpelspezifischen Eigenschaften wieder ausbilden (Redifferenzierung). Die Analyse der Genexpression der NOS-Isoformen humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten auf RNA-Ebene ergab neben der, in der Literatur bereits beschriebenen induzierbaren NOS die Expression zweier weiterer Isoformen, der neuronalen und der endothelialen NOS. In weiteren Versuchen wurde der Effekt verschiedener Mediatoren auf die Genexpression der Gelenkknorpelzellen beobachtet. So wurden Zellaggregate w{\"a}hrend verschiedener Phasen der Redifferenzierung mit rhIL-1 beta bzw. rhTNF alpha stimuliert. Die Chondrozyten reagierten darauf mit einer starker Induktion der induzierbaren NOS sowie mit einem konsekutiven Anstieg der NO-Freisetzung. Die eNOS-Expression wurde negativ reguliert. Auf die Konzentration der nNOS-Transkripte hatten beide Zytokine keinen messbaren Einfluss. Zudem konnte auf diesen Reiz hin eine drastische Reduktion der Kollagen Typ II und Aggrecan-Expression festgestellt werden. In Zusatzversuchen, bei denen u.a. ein NO-Donor und ein NOS-Inhibitor zum Einsatz kamen wurde dieser Effekt genauer erforscht. Aus den gewonnenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Effekt von IL-1 beta und TNF alpha auf die Synthese der beiden wichtigen Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan zumindest teilweise {\"u}ber NO vermittelt wird. In mehren Versuchsreihen gelang es des Weiteren die besondere Bedeutung von NO f{\"u}r die Zelldifferenzierung zu belegen. Die Modifikation des verwendeten chondrogenen Differenzierungsmediums durch Zusatz des NOS-Inhibitors NG-Amino-L-Arginin (L-NAA) f{\"u}hrte zu einer deutlich fr{\"u}heren bzw. st{\"a}rkeren Expression der beiden chondrogenen Markergene Kollagen Typ II und Aggrecan.}, language = {de} } @phdthesis{Wycislo2007, author = {Wycislo, Matthias}, title = {Endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (NOS-III) reguliert die Proliferation neuraler Stammzellen im adulten Gyrus dentatus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30355}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Proliferation von in der Subgranul{\"a}rzone des Gyrus dentatus ans{\"a}ssigen neuralen Stammzellen ist der erste Schritt der Neuentstehung von Nervenzellen im adulten Organismus, der so genannten adulten Neurogenese, die in bestimmten neurogenen Nischen des ZNS von S{\"a}ugetieren und des Menschen vorkommt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das Enzym endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (NOS-III bzw. eNOS) bzw. durch NOS-III gebildetes Stickstoffmonoxid (NO) die Proliferation neuraler Stamm- bzw. Vorl{\"a}uferzellen im Gyrus dentatus des Hippokampus positiv reguliert, da M{\"a}use, bei denen das Gen f{\"u}r dieses Enzym deletiert ist, {\"u}ber eine signifikant erniedrigte Stammzellproliferation verf{\"u}gen. NOS-III-Knockout-M{\"a}use zeigen außerdem erh{\"o}hte Volumina von Substrukturen des Gyrus dentatus. Biometrische Faktoren, wie z. B. Alter, Geschlecht, K{\"o}rpergewicht, Umgebungsbedingungen, hatten dagegen keinen signifikanten Einfluss auf die adulte Neurogenese. Die Abnahme der adulten Neurogenese bei NOS-III-Knockout-Tieren ist fast vollst{\"a}ndig auf die Reduktion der Stammzellproliferation in der Subgranul{\"a}rzone des Gyrus dentatus zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Ein Netto-Zuwachs an neu gebildeten Neuronen 4 Wochen nach Proliferation kann jedoch durch NOS-III nicht bewirkt werden, was auf eine komplexe Regulation der adulten Neurogenese hinweist. Die Stammzellproliferation im adulten murinen Gyrus dentatus wird jedoch vermutlich unter anderem {\"u}ber im Endothel gebildetes NO (als gasf{\"o}rmiges, parakrines Signalmolek{\"u}l) vermittelt.}, subject = {Neurogenese}, language = {de} } @phdthesis{Mishina2007, author = {Mishina, Tatiana E.}, title = {Mechanisms of local and systemic defences in Arabidopsis thaliana in response to host and non-host strains of Pseudomonas syringae}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23160}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Stickstoffmonooxid (NO) wird als wichtige Signalkomponente bei der Entwicklung der Hypersensitiven Reaktion beschrieben. Außerdem wird NO eine Rolle als Signalmolek{\"u}l bei der Expression von Abwehrgenen wie PR-1, PAL1 oder Chalkonsynthase (CHS) und bei der Akkumulation von Salicyls{\"a}ure zugeordnet (Durner et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden transgene Pflanzen mit ver{\"a}nderten endogenen NO-Spiegeln verwendet, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Arabidopsis-Pflanzen, die aufgrund der Expression einer NO Dioxygenase erniedrigte NO-Gehalte aufweisen, zeigen nach einem Angriff avirulenter Pathogene einen abgeschw{\"a}chten oxidative burst und eine reduzierte Expression von Genen des Phenylpropanbiosyntheseweges. Weitere Experimente mit transgenen Pflanzen, die eine bakterielle NO-Synthase exprimieren, legen nahe, dass eine konstitutive Erh{\"o}hung der NO-Spiegel nicht zu einer konstitutiv verst{\"a}rkten Pathogenabwehr f{\"u}hrt. M{\"o}glicherweise ist eine graduelle Steigerung der NO-Gehalte nach Pathogenkontakt f{\"u}r die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen erforderlich. Im Gegenteil, die NOS-exprimierenden Pflanzen waren anf{\"a}lliger gegen bakterielle Pathogene als Wildtyp-Pflanzen und zeigten eine abgeschw{\"a}chte SAR-Reaktion. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass NO eine wichtige Rolle bei der Regulation des Redoxstatus in der Pflanzenzelle spielt. Diese Funktion von NO ist wichtig beim Seneszenzvorgang. Entsprechend der Ergebnisse dieser Arbeit kann NO als negativer Regulator der Blattseneszenz angesehen werden. Die Wirkungsweise von NO auf molekularer Ebene und die Signalkaskaden, in die NO involviert ist, sind immer noch nicht ausreichend verstanden. In zuk{\"u}nftigen Experimenten wird es notwendig sein, die selektive Quantifizierung von NO in intaktem Pflanzengewebe zu gew{\"a}hrleisten, die Proteintargets von NO zu identifizieren und die Struktur und Funktion NO-modifizierter Biomolek{\"u}le zu entschl{\"u}sseln, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen besser verstehen zu lernen. Die Nichtwirtsresistenz beruht auf mehreren Verteidigungsebenen, welche konstitutive und induzierte Komponenten beinhalten. Die Bedeutung induzierter Abwehrreaktionen f{\"u}r die Nichtwirtsresistenz gegen bakterielle Pathogene ist nicht vollst{\"a}ndig klar. Die Daten der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass das Wachstum von Nichtwirtsbakterien in Arabidopsis-Bl{\"a}ttern durch vorgebildete toxische Substanzen und durch induzierte Zellwandverst{\"a}rkungen gehemmt wird. Nichtwirtsbakterien verursachen eine schnelle Induktion der Expression der Ligninbiosynthesegene PAL1 und BCB, die unabh{\"a}ngig vom Typ III-Sekretionssystem ist und m{\"o}glicherweise zur Papillenbildung beitr{\"a}gt. Dar{\"u}ber hinaus ist die {\"U}berlebensrate der Nichtwirtsbakterien in den extrazellul{\"a}ren R{\"a}umen der Arabidopsis pal1-Mutante h{\"o}her als in Wildtyp-Pflanzen, was die funktionelle Bedeutung der PAL1-Expression bei der Nichtwirtsresistenz verdeutlicht. Außerdem zeigen die Experimente, dass Nichtwirtsbakterien in {\"a}hnlicher Weise wie Wirtsbakterien die Akkumulation von Salicyls{\"a}ure und die Expression von PR-Genen induzieren. Die Induktion dieser Abwehrkomponenten ist abh{\"a}ngig von einem intakten Typ III-Sekretionssystem. Die Signalwege, auf denen nach Kontakt mit Nichtwirtsbakterien und Wirtsbakterien Abwehrreaktionen induziert werden, sind {\"a}hnlich. Es wurden jedoch zwischen zwei verschiedenen Nichtwirtsst{\"a}mmen auch unterschiedliche Signalwege aktiviert, was m{\"o}glicherweise auf ein unterschiedliches Repertoire von TypIII-Effektoren der beiden St{\"a}mme zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden kann. Trotz der Aktivierung dieser induzierten Abwehr zeigen Experimente mit klassischen Abwehrmutanten, dass SA- und JA-abh{\"a}ngige Abwehrreaktionen nicht direkt zur Nichtwirtsresistenz gegen P. syringae beitragen. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die Nichtwirtsresistenz des Arabidopsis-{\"O}kotyps Col-0 effektiver ist als die des Ler-0-{\"O}kotyps, obwohl bei letzterem die Resistenz gegen virulente Bakterien h{\"o}her ist. Diese Unterschiede scheinen nicht mit der unterschiedlichen Glucosinolatzusammensetzung der beiden {\"O}kotypen im Zusammenhang zu stehen. Um das Verst{\"a}ndnis der Nichtwirtsresistenz von Arabidopsis gegen{\"u}ber P. syringae zu verbessern, k{\"o}nnen in zuk{\"u}nftigen Experimenten Doppel- und Triplemutanten hergestellt werden, die gleichzeitig Defekte in der zellwandabh{\"a}ngigen Abwehr (Lignin- und Callosebiosynthese) und in klassischen, SA-abh{\"a}ngigen Abwehrreaktionen aufweisen. Auch k{\"o}nnen Analysen des Genom-Polymorphismus und der Zusammensetzung von Sekund{\"a}rmetaboliten in den {\"O}kotypen Ler-0 und Col-0 zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Nichtwirtsresistenz f{\"u}hren. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass ein lokaler, symptomfreier Kontakt von Arabidopsis-Bl{\"a}ttern mit Nichtwirtsbakterien, TTSS-defiziente Bakterien und allgemeine bakterielle Elicitoren (PAMPs) wie Flagellin und Lipopolysaccharide die systemisch erworbene Resistenz innerhalb der Gesamtpflanze hervorrufen. Die symptomlose systemische Resistenzreaktion findet in SAR-defizienten Mutanten nicht statt, wird jedoch in der Jasmonat-insensitiven jar1-Mutante, die keine ISR-Reaktion ausbilden kann, beobachtet. Durch Behandlung von Arabidopsis-Bl{\"a}ttern mit unterschiedlichen Inokuli von virulenten oder avirulenten P. syringae-St{\"a}mmen wurde auch eine deutliche Korrelation des Ausmaßes der SAR-Induktion mit der H{\"o}he der SA-Akkumulation oder der PR-Genexpression, aber nicht mit der Nekrosenbildung oder der JA-Produktion, am Infektionsort festgestellt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass nicht die Hypersensitive Reaktion oder Gewebenekrosen, sondern m{\"o}glicherweise die St{\"a}rke bestimmter Abwehrreaktionen am Ort der Inokulation zur Ausl{\"o}sung der SAR beitragen. Die Befunde, dass die systemische Resistenz auch durch PAMPs und durch TTSS-defekte P. syringae-St{\"a}mme erh{\"o}ht wird, verdeutlicht die wichtige Rolle von allgemeinen Elicitoren bei der SAR-Induktion. In k{\"u}nftige Experimenten kann untersucht werden, ob verschiedene PAMPs die SAR in synergistischer Weise induzieren und ob allgemeine Elicitoren pilzlicher Herkunft SAR ausl{\"o}sen k{\"o}nnen. Weiterhin k{\"o}nnen die molekulare Prozesse spezifiziert werden, die stromabw{\"a}rts von PAMP-Erkennungsprozessen f{\"u}r die SAR-Ausbildung notwendig sind. In weiteren Experimenten k{\"o}nnte die Hypothese {\"u}berpr{\"u}ft werden, ob einzelner PAMPs als mobile SAR-Langstreckensignale fungieren k{\"o}nnen. Durch phytopathologische Charakterisierung von T-DNA-Knockout-Linien, die Defekte in Genen aufweisen, welche in Arabidopsis nach einer P. syringae-Infektion aufreguliert werden, konnte das FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1)-Gen als notwendige Komponente der SAR in Arabidopsis identifiziert werden. So bleiben die im Wildtyp induzierten systemischen Abwehrreaktionen und die Erh{\"o}hung der systemischen Resistenz nach lokaler Inokulation mit P. syringae in fmo1-Knockout-Pflanzen vollst{\"a}ndig aus. Weiterhin korreliert die systemische Expression des FMO1-Gens eng mit der SAR-Induktion. So gibt es bei allen Abwehrmutanten, die keine SAR nach Kontakt mit P. syringae ausbilden k{\"o}nnen, keine FMO1-Expression in distalen Bl{\"a}ttern inokulierter Pflanzen. Umgekehrt verh{\"a}lt es sich mit Arabidopsis-Linien, die die SAR ausbilden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass FMO1 eine wichtige Komponente eines Signalverst{\"a}rkungszyklus darstellt, der in nichtinfizierten, systemischen Teilen der Pflanze wirkt, um die SAR zu erm{\"o}glichen. In k{\"u}nftigen Experimenten soll der postulierte Amplifizierungsmechanismus experimentell verifiziert werden. Die Konstruktion von transgenen Linien, die ein FMO1:GFP-Fusionsprodukt exprimieren, kann Informationen {\"u}ber die zellu{\"a}re Lokalisation des FMO1-Proteins liefern. Weiterhin k{\"o}nnen vergleichende Analysen der chemischen Zusammensetzung von Blattextrakten der fmo1 Knockout-Linien, von FMO1-{\"U}berexprimierern und von Wildtyp-Pflanzen zur Aufkl{\"a}rung der biochemischen Reaktion beitragen, die die FMO1-Monooxygenase katalysiert. In Anlehnung an die Funktion von yFMO, die die einzige Flavin-abh{\"a}ngige Monooxygenase der Hefe darstellt, kann {\"u}berpr{\"u}ft werden, ob FMO1 die korrekte Faltung von Proteinen am endoplasmatischen Retikulum vermittelt. Schließlich kann durch die Identifizierung weitere SAR-Gene nach der beschriebenen Strategie und durch funktionelle Charakterisierung der zugeh{\"o}rigen Proteine das Verst{\"a}ndnis der SAR-Reaktion auf molekularer Ebene weiter verbessert werden.}, subject = {Ackerschmalwand}, language = {en} } @phdthesis{Hoetten2007, author = {H{\"o}tten, Stefanie Brigitte}, title = {Atheroprotektive Effekte der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase in Apolipoprotein-E-Knockout-M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22093}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {In dieser Arbeit wurde die Rolle der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase in der spontanen Atheroskleroseentwicklung untersucht. Die Untersuchungen wurden an Apolipoprotein E-Knockout /neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout-M{\"a}usen und Apolipoprotein E-Knockout-M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt, die zuvor 14 bzw. 24 Wochen mit einer ‚western-type'-Di{\"a}t gef{\"u}ttert worden sind. Durch eine immunhistochemische Analyse konnte zun{\"a}chst gezeigt werden, dass neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase in Plaques von Apolipoprotein E-Knockout M{\"a}usen exprimiert wird. Nach 14 Wochen ‚western-type'- Di{\"a}t zeigten m{\"a}nnliche Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere eine signifikante Zunahme der \%-L{\"a}sionsfl{\"a}che um 66\%. Im Gegensatz dazu war die \%-L{\"a}sionsfl{\"a}che der weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere nach 14 Wochen unver{\"a}ndert, zeigte aber nach 24 Wochen eine signifikante Zunahme um 32 \%. Aortengesamtfl{\"a}che, K{\"o}rpergewicht und Plasmacholesterinspiegel waren zwischen gleichgeschlechtlichen Tieren der verschiedenen Genotypen unver{\"a}ndert. Der mittlere arterielle Blutdruck der weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere war signifikant reduziert, bei den m{\"a}nnlichen Tieren fand sich kein Blutdruckunterschied. Dieser Befund k{\"o}nnte eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r die verz{\"o}gerte Plaqueentwicklung bei weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tieren darstellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass ein Mangel an neuronaler Stickstoffmonoxid-Synthase zu einer deutlichen Zunahme der Atherosklerose f{\"u}hrt, so dass ein atheroprotektiver Effekt der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase angenommen werden kann.}, language = {de} } @phdthesis{Rosel2007, author = {Rosel, Eva Annemarie}, title = {Die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) in der Endothelaktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27824}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) f{\"u}r die Endothelaktivierung. F{\"u}r diese Untersuchungen wurde die MLEC-Zellkulturtechnik (murine lung endothelial cells) und die Gegen{\"u}berstellung des Wiltyp- und eNOS-Knockout-Genotyps verwendet. Die MLEC-Kulturen wurden aus dem mikrovaskul{\"a}ren Stromgebiet der Lungen von C57Bl6-Wildtyp-M{\"a}usen (WT) und von eNOS-Knockout-M{\"a}usen (KO) angelegt und immunomagnetisch (Anti-CD102) zweifach selektioniert. Die Reinheit der Kulturen f{\"u}r Endothelzellen nach zwei Selektionen lag bei {\"u}ber 95\%. WT-Endothelzellen produzieren eine basale Menge an Stickstoff-Monoxid (NO). Sie steigern ihre NO-Produktion nach Stimulation mit VEGF (vascular endothelium growth factor), mit dem Kalzium-Ionophor Ionomycin sowie unter Scherkraftexposition. Die eNOS-Proteinexpression erh{\"o}ht sich dementsprechend nach 12 Stunden Scherkraftexposition. WT- und eNOS-KO-Endothelzellen unterscheiden sich unter basalen Bedingungen nicht in ihrer Oberfl{\"a}chenexpression der Adh{\"a}sionsmolek{\"u}le ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin und VCAM-1. Nach Zytokin-Stimulation erh{\"o}hen beide Genotypen ihr Adh{\"a}sionsmolek{\"u}lprofil in gleicher Weise. Sowohl WT- als auch eNOS-KO-Endothelzellen verf{\"u}gen zudem {\"u}ber einen schnellen Mechanismus, der die Hochregulation der P-Selektin-Oberfl{\"a}chenexpression nach Stimulation mit Thrombin oder Menadion in gleicher Weise erm{\"o}glicht. Auf Stimulation mit Thrombin oder Menadion reagieren WT-Zellen mit einem signifikanten Anstieg der Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen (ROS, rapid oxygen species). eNOS-KO-Zellen zeigen eine im Vergleich zum WT erh{\"o}hte basale ROS-Produktion. Diese l{\"a}sst sich auch nach Stimulation nicht weiter steigern. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die MLEC-Zellkulturtechnik ein verl{\"a}ssliches Modell f{\"u}r Untersuchungen an Gef{\"a}ßendothelzellen darstellt. eNOS-KO-Zellen exprimieren nicht automatisch mehr Adh{\"a}sionsmolek{\"u}le an der Zelloberfl{\"a}che als WT-Zellen. Allerdings ist die basale Produktion von ROS in eNOS-KO-Zellen vermehrt. Folglich ist in diesem Modell eNOS nicht f{\"u}r die konstitutive Suppression der endothelialen Aktivierung verantwortlich. Der NO-Effekt kann nicht in einer direkten und kontinuierlichen Unterdr{\"u}ckung der endothelialen Oberfl{\"a}chenaktivierung liegen. Das Fehlen von NO f{\"u}hrt vielmehr zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem Radikalf{\"a}nger NO und O2- (Superoxid) zugunsten von O2-. Aufgrund dieses Ungleichgewichts ist die basale ROS-Produktion von eNOS-KO-Zellen vermutlich erh{\"o}ht. Damit wird die Endothelzelle empfindlicher gegen{\"u}ber zus{\"a}tzlichem oxidativen Stress. Die eNOS-KO-Zellen k{\"o}nnen die h{\"o}here ROS-Belastung in den durchgef{\"u}hrten Untersuchungen kompensieren. Es ist aber denkbar, dass bei zus{\"a}tzlichem oxidativen Stress ein erh{\"o}htes Maß an O2- das Startsignal f{\"u}r die Abl{\"a}ufe der endothelialen Aktivierung darstellt.}, subject = {Stickstoffmonoxid}, language = {de} } @phdthesis{Hemberger2009, author = {Hemberger, Melinda}, title = {Verbesserung der vaskul{\"a}ren Dysfunktion bei Diabetes mellitus durch den HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35304}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Diabetes ist assoziiert mit einer endothelialen Dysfunktion sowie einer vermehrten Aktivierung von Thrombozyten. Beides erh{\"o}ht wahrscheinlich das Risiko eines kardiovaskul{\"a}ren Ereignisses. In der vorliegenden experimentellen Arbeit wurde untersucht, ob der Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl (HMG)-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin zu einer Verbesserung der Endotheldysfunktion und einer Reduktion der Thrombozyten-Aktivierung im diabetischen Tiermodell beitr{\"a}gt. Zu diesem Zweck wurde m{\"a}nnlichen Wistar Ratten einmalig Beta-Zell-toxisches Streptozotocin injiziert und dadurch k{\"u}nstlich ein Diabetes mit persistierender Hyperglyk{\"a}mie erzeugt. Die Behandlung mit Rosuvastatin (20 mg/kg K{\"o}rpergewicht t{\"a}glich) beziehungsweise Placebo wurde zwei Wochen nach Induktion der Hyperglyk{\"a}mie begonnen und {\"u}ber zwei weitere Wochen fortgef{\"u}hrt. Die Gef{\"a}ßfunktion wurde anschließend an isolierten Aortensegmenten im Organbad gemessen, die Bestimmung der Thrombozyten-Aktivierung erfolgte in frischem Vollblut. Die endothelabh{\"a}ngige Relaxation der Gef{\"a}ße, induziert durch den rezeptorabh{\"a}ngigen Agonisten Acetylcholin, war in diabetischen Ratten signifikant vermindert und konnte durch die Rosuvastatin-Therapie verbessert werden. Dies ließ sich haupts{\"a}chlich auf eine deutlich reduzierte Sensitivit{\"a}t der Gef{\"a}ßmuskulatur f{\"u}r Stickstoffmonoxid (NO) zur{\"u}ck f{\"u}hren, welche bei den diabetischen Tieren durch eine gesteigerte Superoxidbildung bedingt war. Rosuvastatin reduzierte signifikant die Bildung der Sauerstoffradikalen und verbesserte dar{\"u}ber hinaus die NO-Sensitivit{\"a}t. Weiterhin konnte durch die HMG-CoA-Reduktase-Inhibition die Bindung von Fibrinogen an aktiviertes GPIIb/IIIa, sowie die P-Selektin-Expression auf der Thrombozytenoberfl{\"a}che als Marker der Thrombozyten-Degranulation reduziert werden, w{\"a}hrend diese beiden Marker der Thrombozyten-Aktivierung in der Placebo-behandelten diabetischen Versuchsgruppe erh{\"o}ht waren. Aus diesen Ergebnissen l{\"a}sst sich schlussfolgern, dass eine Behandlung mit dem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin bei diabetischen Ratten die Endotheldysfunktion der Gef{\"a}ße verbessert und die Aktivierung von Thrombozyten durch eine verbesserte Verf{\"u}gbarkeit des endogenen Thrombozyten-Inhibitors NO vermindert. {\"U}bertragen auf das menschliche Gef{\"a}ßsystem k{\"o}nnte dieser Effekt zu einer Verminderung kardiovaskul{\"a}rer Ereignisse durch eine Statin-Therapie bei Patienten mit Diabetes beitragen.}, subject = {Diabetes mellitus}, language = {de} } @phdthesis{Uhlenhut2012, author = {Uhlenhut, Klaus}, title = {Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72102}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Um die Grundlagen f{\"u}r die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellul{\"a}ren Ebene aufzukl{\"a}ren, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entz{\"u}ndlichen Vorg{\"a}ngen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gef{\"a}ß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Ged{\"a}chtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgef{\"u}hrten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabh{\"a}ngige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entz{\"u}ndungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enth{\"a}lt, und Hydrocortison zeigte M1 zus{\"a}tzlich einen st{\"a}rkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entz{\"u}ndungsreiz. Die Zytotoxizit{\"a}t von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalf{\"a}ngereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabh{\"a}ngiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine m{\"o}gliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, prim{\"a}ren Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise f{\"u}r eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranst{\"a}ndige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ans{\"a}tze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren {\"u}ber die Testzeitr{\"a}ume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl {\"u}ber kurze (≤ 45 min) als auch {\"u}ber l{\"a}ngere Zeitr{\"a}ume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivit{\"a}t der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabh{\"a}ngige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazellul{\"a}re NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in j{\"u}ngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universit{\"a}tsklinikum Z{\"u}rich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 w{\"o}chiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gef{\"a}ßerweiterungskapazit{\"a}t (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Ver{\"a}nderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 f{\"u}hrte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur m{\"o}glichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgew{\"a}hlten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich h{\"o}heren Verteilung ins Gehirn f{\"u}r die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechus{\"a}ure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankeng{\"a}ngig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den h{\"o}chsten logBB-Wert und somit die h{\"o}chste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu {\"u}berwinden. Im Kontext einer m{\"o}glichen Anwendung bei chronisch-entz{\"u}ndlichen Erkrankungen wurde zus{\"a}tzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem prim{\"a}ren Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entz{\"u}ndungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverd{\"u}nnungen deutliche konzentrationsabh{\"a}ngige Hemmeffekte um bis zu ~50 \% der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beitr{\"a}ge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verst{\"a}ndnis der m{\"o}glichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden.}, subject = {Stickstoffmonoxid}, language = {de} } @article{MontoyaPelaezSierraAlzateetal.2013, author = {Montoya Pel{\´a}ez, Guillermo L. and Sierra, Jelver A. and Alzate, Fernando and Holzgrabe, Ulrike and Ramirez-Pineda, Jos{\´e} R.}, title = {Pentacyclic triterpenes from Cecropia telenitida with immunomodulatory activity on dendritic cells}, series = {Revista Brasileira de Farmacognosia - Brazilian Journal of Pharmacognosy}, volume = {23}, journal = {Revista Brasileira de Farmacognosia - Brazilian Journal of Pharmacognosy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-131851}, pages = {754-761}, year = {2013}, abstract = {Pentacyclic triterpenes are a large family of plant metabolites that exhibit a wide array of biological activities. The genus Cecropia, which encompasses many plant species, has been used as traditional medicine for the treatment of inflammatory diseases and is known to produce many active pentacyclic triterpenes. In this study we investigated the chemical composition of a pentacyclic triterpene fraction from the roots of Cecropia telenitida Cuatrec., Urticaceae. A novel compound, which we termed yarumic acid, and four known molecules (serjanic acid, spergulagenic acid A, 20-hydroxy-ursolic acid and goreishic acid I) were isolated and characterised. In a dendritic cell (DC)-based assay, we demonstrated that non-toxic doses of these pentacyclic triterpenes inhibited the secretion of at least one of the proinflammatory cytokines tested (IL-1 beta, IL-12p40, IL-12p70, TNF-alpha). Spergulagenic acid A also inhibited nitric oxide production in lipopolysaccharide-stimulated dendritic cell. Serjanic acid and spergulagenic acid A, which were the most potent abundant compounds in the pentacyclic triterpene fraction, showed the most activity in the dendritic cell-based assay. These results show that all pentacyclic triterpenes might contribute to the anti-inflammatory activities of C. telenitida. Moreover, yarumic acid as well as the four known pentacyclic triterpenes, can be exploited as potential immunomodulatory/anti-inflammatory agents.}, language = {en} } @article{PreisingSchneiderBucheretal.2015, author = {Preising, Christina and Schneider, Reinhard and Bucher, Michael and Gekle, Michael and Sauvant, Christoph}, title = {Regulation of expression of renal organic anion transporters OAT1 and OAT3 in a model of ischemia/reperfusion injury}, series = {Cellular Physiology and Biochemistry}, volume = {37}, journal = {Cellular Physiology and Biochemistry}, number = {1}, doi = {10.1159/000430328}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-144504}, year = {2015}, abstract = {Background: Recently, we gained evidence that impairment of rOat1 and rOat3 expression induced by ischemic acute kidney injury (AKI) is mediated by COX metabolites and this suppression might be critically involved in renal damage. Methods: (i) Basolateral organic anion uptake into proximal tubular cells after model ischemia and reperfusion (I/R) was investigated by fluorescein uptake. The putative promoter sequences from hOAT1 (SLC22A6) and hOAT3 (SCL22A8) were cloned into a reporter plasmid, transfected into HEK cells and (ii) transcriptional activity was determined after model ischemia and reperfusion as a SEAP reporter gen assay. Inhibitors or antagonists were applied with the beginning of reperfusion. Results: By using inhibitors of PKA (H89) and PLC (U73122), antagonists of E prostanoid receptor type 2 (AH6809) and type 4 (L161,982), we gained evidence that I/R induced down regulation of organic anion transport is mediated by COX1 metabolites via E prostanoid receptor type 4. The latter signaling was confirmed by application of butaprost (EP2 agonist) or TCS2510 (EP4 agonist) to control cells. In brief, the latter signaling was verified for the transcriptional activity in the reporter gen assay established. Therein, selective inhibitors for COX1 (SC58125) and COX2 (SC560) were also applied. Conclusion: Our data show (a) that COX1 metabolites are involved in the regulation of renal organic anion transport(ers) after I/R via the EP4 receptor and (b) that this is due to transcriptional regulation of the respective transporters. As the promoter sequences cloned were of human origin and expressed in a human renal epithelial cell line we (c) hypothesize that the regulatory mechanisms described after I/R is meaningful for humans as well.}, language = {en} }