@phdthesis{Tyrsin2003,
  author    = {Tyrsin, Oleg},
  title     = {Role of Raf family members in mouse development},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9453},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Raf Proteine sind Serin/Threonin Kinasen, die als zentrale Elemente des Ras, Raf, Mek, Map Kinase Wegs, an der Weiterleitung von extrazellul{\"a}ren Signalen von der Zellmembran zu nukle{\"a}ren Effektoren beteiligt sind. Auf diese Weise kontrollieren sie elementare Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und das {\"U}berleben von Zellen. In S{\"a}ugetieren wurden drei funktionelle Gene (A-, B- and C-raf) beschrieben. Aus biochemischen Untersuchungen ergibt sich, dass die Isozyme {\"u}berlappende aber auch differentielle Funktionen {\"u}bernehmen. Allerdings wurde ein differenziertes Verst{\"a}ndnis der jeweiligen spezifischen Rolle dadurch erschwert, dass in den meisten Zelltypen verschiedene Raf-Isozyme expremiert werden und dass wegen der Vielzahl der Aktivatoren und Effektoren eine eindeutige Isoform-Zuordnung schwer m{\"o}glich war. Aufgrund der Beteiligung an verschiedenen Krankheitsbildern, insbesondere der Tumorentstehung und -progression, ist jedoch die Aufkl{\"a}rung der Isozym-spezifischen Funktionen von vorranginger wissenschaftlicher Bedeutung. B-Raf hat unter den Raf Kinasen die h{\"o}chste Kinaseaktivit{\"a}t und zeigt antiapoptotische Eigenschaften. B-Raf knockout M{\"a}use zeigen eine allgemeine Wachstumsverz{\"o}gerung und sterben zwischen E10,5 und E12,5 aufgrund fehlentwickelter Gef{\"a}sse in Folge massiver Apoptose differenzierter Endothelzellen. [1]. Um die Lethalit{\"a}t des B-Raf-/- (KO) Ph{\"a}notyps zu {\"u}berkommen und um die Redundanz der B-Raf Proteine weiter zu untersuchen, wurden M{\"a}use generiert, die unter der Kontrolle des B-Raf Promoters statt B-Raf eine A-Raf cDNA exprimieren. Nur in einem Fall entwickelte sich eine ausgewachsene p20 Maus ohne sichtbare Entwicklungsdefekte oder Verhaltensauff{\"a}lligkeiten. Dar{\"u}ber hinaus wurden lebende Embryonen mit normaler Entwicklung aber reduzierter Gr{\"o}sse mit niedriger Inzidenz zwischen E12,5d und E16,5d beobachtet. In allen diesen F{\"a}llen fanden wir ein intaktes Gef{\"a}ßsystem. Andererseits waren Neurogenese und die Bewegung der neuralen Vorl{\"a}uferzellen in den {\"u}berlebenden Embryonen gest{\"o}rt, was in einigen F{\"a}llen zu unterentwickelten Hirnregionen f{\"u}hrte. Mittels TUNEL bzw. PCNA Assay konnten wir zeigen, dass mehr apoptotische und weniger proliferierende Zellen in ventrikul{\"a}rer und subventrikul{\"a}rer Zone der Hirn Ventrikel und im Striatum der KIN Embryonen zu finden sind. Außerdem wurden in einer Reihe von Geweben von E13,5d und in den Lungen von E16,5d Embryonen, vermehrt apoptotische Zellen beobachtet. Dies war in der einen ausgewachsenen KIN Maus nicht der Fall. Diese zeigte einen reduzierten Anteil an neuronalen Vorl{\"a}uferzellen in der subgranul{\"a}ren Zone des Hippocampus und an reifen Neuronen im Riechkolben. Ansonsten waren aber keine St{\"o}rungen der Neurogenese in der ausgewachsenen KIN Maus detektierbar. Fibroblasten die aus KIN Embryonen etabliert wurden, zeigten im Vergleich zu Wildtypzellen reduzierte F{\"a}higkeit zur Proliferation und erh{\"o}hte Sensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber Apoptoseausl{\"o}sern. Die erh{\"o}hte Apoptosetendenz spiegelte sich auf molekularer Ebene in einer Reduktion an antiapoptotischen Molek{\"u}len wieder. Aktive ERK und Akt Kinase sind erniedrigt. Außerdem war von dem bekannten Raf Substrat BAD, weniger an der inaktiven phosphorylierten Form zu beobachten, wodurch bei gleicher Menge Gesamtprotein auf ein Mehr an proapoptotischem unphosphoryliertem BAD geschlossen werden kann. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Substitution von B-Raf durch die weniger aktive A-Raf Kinase zwar die endotheliale Apoptose verhindern kann, die die Ursache f{\"u}r das fr{\"u}he Absterben der B-Raf-/- (KO) M{\"a}use ist, dass aber die normale Entwicklung dennoch entscheidend gest{\"o}rt ist.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Stuermer2004,
  author    = {St{\"u}rmer, Andrea},
  title     = {Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgel{\"o}st wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin f{\"u}r den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den pr{\"a}replikativen Komplex vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzukl{\"a}ren. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellul{\"a}ren Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-F{\"a}rbung mit Antik{\"o}rpern gegen eine konservierte Dom{\"a}ne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antik{\"o}rpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch f{\"u}r die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte {\"u}ber Immunpr{\"a}zipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin pr{\"a}zipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine w{\"a}hrend der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down" des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System erm{\"o}glicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte St{\"o}rung des Zellwachstums hin. Zus{\"a}tzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollst{\"a}ndig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen m{\"o}glichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auff{\"a}llig h{\"a}ufig lagen in MCM3-„knock-down"-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Ph{\"a}notypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukle{\"a}rer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down"-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des pr{\"a}replikativen Komplexes eine zus{\"a}tzliche Funktion in der Mitose aus{\"u}ben.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Petrovic2004,
  author    = {Petrovic, Suzana},
  title     = {In vivo analysis of homing pattern and differentiation potential of cells deriving from embryonic and adult haematopoietic regions},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9323},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {The experimental work of this thesis addresses the questions of whether established cell lines injected into murine blastocysts find their way back home and seed preferentially at the site of their origin. Furthermore, can they change their fate and differentiate to unrelated cell types when exposed to the embryonic environment. This survey was based on the fact that different cell lines have different potentials in developing embryos, dependent on their cellular identity. The cell lines used in this survey were AGM region-deriving DAS 104-4, DAS 104-8 cells, yolk sac-deriving YSE cells and bone marrow-deriving FDCP mix cells. These cells were injected into mouse blastocysts. Donor cells were traced in developing embryos via specific markers. Analysis of the embryos revealed that DAS cells are promiscuous in their seeding pattern, since they were found in all analysed tissues with similar frequencies. YSE cells showed preferences in seeding yolk sac and liver. YSE donor cells in chimaeric tissues were not able to change their immuno-phenotype, indicating that they did not change their destiny. Analysis of adult mice did not reveal any of YSE-derived cells donor contribution. In contrast, FDCP mix cells mostly engrafted haematopoietic tissues, although the embryos analysed by in situ hybridization had donor signals frequently in cartilage primordia, heads, and livers. Analysis of whether FDCPmix-derived cells found in foetal livers were of haematopoietic or hepatocytes nature showed that progeny of injected FDCP mix cells do not differentiate into cells that express a hepatocyte-specific marker. Further analysis showed that FDCPmix-derived donor cells found in brain express neural or haematopoietic markers. In order to reveal if they transdifferentiate to neurons or fuse with neurons/glial cells, nuclear diameters of donor and recipient cells were determined. Comparison of the nuclear diameters of recipient and donor cells revealed no differences. Therefore this suggests that progeny of FDCP mix in brain are not fusion products. Analysis of adult mice tissues revealed that presence of FDCP mix-derived cells was the highest in brains. These results confirmed the assumption that the developmental potential of the analysed cells cannot be easily modified, even when exposed to early embryonic environment. Therefore one can conclude that the analysed cell types had different homing patterns depending on their origins.},
  subject      = {Zelllinie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schmittwolf2004,
  author    = {Schmittwolf, Carolin},
  title     = {Analyse des Differenzierungspotentials muriner h{\"a}matopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8812},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungspotential muriner h{\"a}matopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression untersucht. Zur Ver{\"a}nderung der Genexpression wurden f{\"u}r die beiden adulten Stammzelltypen zwei unterschiedliche experimentelle Ans{\"a}tze gew{\"a}hlt: In h{\"a}matopoetischen Stammzellen wurden molekulare Regulatoren der H{\"a}matopoese durch retroviral vermittelten Gentransfer {\"u}berexprimiert und anschließend ihr in vitro Verhalten und in vivo in Maustransplantationsmodellen ihre Rekonstitutionsf{\"a}higkeit untersucht. Neurale Stammzellen wurden gleichzeitig mit den Chromatin-modifizierenden Substanzen Trichostatin A (TSA) und 5-Aza-2´-desoxycytidin (AzadC) behandelt, im Anschluß ihre Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber der Behandlung in vitro bestimmt und ihr h{\"a}matopoetisches Entwicklungspotential in vivo analysiert. In h{\"a}matopoetischen Stammzellen wurde der Transkriptionsfaktor HOXB4, die h{\"a}matopoetische Vorl{\"a}uferkinase 1 (HPK1) oder eine Kinase-inaktive Mutante der HPK1 (HPK1M46) durch retrovirale Transduktion {\"u}berexprimiert. Der Transfer wildtypischer HPK1 oder HPK1M46 Gene in Knochenmarkzellen hatte in vitro keinen meßbaren Einfluß auf die Proliferation und Anzahl primitiver Vorl{\"a}uferzellen, was auch nach Expression verschiedener Proteinmengen beobachtet wurde. Das Repopulationsverhalten h{\"a}matopoetischer Stammzellen, die mit wildtypischer HPK1 transduziert wurden, war vergleichbar mit dem kontrolltransduzierter Stammzellen. Nach HPK1M46 Transduktion zeigten h{\"a}matopoetische Stammzellen in vivo ein reduziertes Langzeitrepopulationsverhalten und Knochenmarkzellen ex vivo ein eingeschr{\"a}nktes Koloniebildungspotential. Sowohl mit wildtypischer HPK1 als auch mit HPK1M46 transduzierte h{\"a}matopoetische Stammzellen wiesen ein normales Multilinienbesiedlungspotential auf. Nach Transduktion von Knochenmarkzellen mit HOXB4, einem wichtigen Regulator der Selbsterneuerung h{\"a}matopoetischer Stammzellen, konnten diese in vitro expandiert werden, ohne daß sie, wie dies bei kontrolltransduzierten Knochenmarkzellen auftrat, ph{\"a}notypisch Differenzierungsmarker ausbildeten. Nach HOXB4 Transduktion akkumulierte eine homogene, Mac-1niedrig exprimierende Zellpopulation im Gegensatz zu einer Mac-1hoch, Gr-1 sowie c-kit positiven Population, die sich in den Kontrollkulturen entwickelte. Auf mRNS Ebene wurden nur in den Kontrollkulturen Transkripte hochreguliert, die f{\"u}r differenzierende Zellen spezifisch sind, wie z. B. Zyklin D1 w{\"a}hrend myeloider Differenzierung. Die {\"U}berexpression von HOXB4 erm{\"o}glichte eine konstante Proliferationsrate und hatte auf das Verh{\"a}ltnis von asymmetrischen zu symmetrischen Zellteilungen jedoch keinen Einfluß. Entsprechend blieb das Expressionsmuster an Zyklinen, Zyklin-abh{\"a}ngigen Kinasen und Mitgliedern des Transkriptionsaktivators AP-1 in HOXB4 transduzierten Knochenmarkzellen {\"u}ber den beobachteten Zeitraum konstant. Durch die {\"U}berexpression von HOXB4 kann somit in kultivierten Knochenmarkzellen in vitro eine stabile Proliferationsrate induziert und parallel eine fortschreitende Differenzierung der Knochenmarkkultur aufgehalten oder zumindest verz{\"o}gert werden. Sowohl wildtypische als auch bcl-2 transgene neurale Stammzellen, die mit den Epigenotyp-ver{\"a}ndernden Substanzen TSA und AzadC behandelt wurden, zeigten nach Transplantation in bestrahlte adulte Rezipienten h{\"a}matopoetisches Entwicklungspotential, das unbehandelte neurale Stammzellen nicht aufwiesen. Die Frequenz chim{\"a}rer Tiere konnte durch Verwendung bcl-2 transgener neuraler Stammzellen erh{\"o}ht werden und bereits in vitro wiesen wildtypische und bcl-2 transgene neurale Stammzellen unterschiedliche Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber der TSA/AzadC Behandlung auf. Diese von behandelten neuralen Stammzellen vermittelte Rekonstitution des h{\"a}matopoetischen Systems war langanhaltend und fand sowohl in der myeloiden als auch in der lymphoiden Linie statt. Eine erfolgreiche h{\"a}matopoetische Besiedlung war auch nach Transplantation klonaler neuraler Stammzellen zu beobachten, so daß eine Verunreinigung mit h{\"a}matopoetischen Zellen als Ursache der Rekonstitution ausgeschlossen werden konnte. Die beobachtete Generierung der morphologisch und ph{\"a}notypisch intakten h{\"a}matopoetischen Zellen aus neuralen Zellen war nicht das Ergebnis einer Zellfusion von Rezipientenzellen mit injizierten Donorzellen. Denn die h{\"a}matopoetischen Donorzellen trugen einen normalen 2n Karyotyp und wiesen keine Heterokaryons auf, die f{\"u}r Fusionen charakteristisch w{\"a}ren. Somit ist es m{\"o}glich, durch die Ver{\"a}nderung des Epigenotyps neuraler Stammzellen gefolgt von einer Transplantation in eine h{\"a}matopoetische Mikroumgebung eine Transdifferenzierung neuraler in h{\"a}matopoetische Zellen zu induzieren.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Buecheler2003,
  author    = {B{\"u}cheler, Markus},
  title     = {Regulation der Neurotransmission im zentralen Nervensystem durch alpha2-adrenerge Rezeptoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7803},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Die Gruppe der adrenergen Rezeptoren (AR) umfasst neun Rezeptoren (3 alpha1-, 3 alpha2-, 3 beta-AR), die alle durch die physiologischen Liganden Adrenalin und Noradrenalin aktiviert werden k{\"o}nnen. Eine Subgruppe der AR bilden die drei alpha2-AR alpha2A, alpha2B und alpha2C. Sie k{\"o}nnen pr{\"a}- oder postsynaptisch lokalisiert sein. Pr{\"a}synaptisch lokalisierte alpha2-AR hemmen die Transmitterfreisetzung im Sinne einer negativen R{\"u}ckkopplung. Die Hauptrolle bei der pr{\"a}synaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung spielen alpha2-AR vom Subtyp alpha2A. Es lagen zu Beginn dieser Arbeit auch Hinweise vor, daß noch weitere alpha2-Rezeptorsubtypen an dieser Funktion beteiligt sind. Eine eindeutige Zuordnung dieser alpha2-AR zu den Subtypen alpha2B oder alpha2C gelang aber bisher nicht. In dieser Arbeit sollte deshalb die Frage beantwortet werden, welche alpha2-AR neben dem alpha2A-AR an der pr{\"a}synaptischen Hemmung der Transmitterfreisetzung im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Zur Subtypunterscheidung wurden "knockout"-M{\"a}use verwendet, die nur einen oder zwei alpha2-Rezeptorsubtypen exprimierten. Gehirnschnitte aus dem Neokortex und den Basalganglien dieser Mauslinien wurden mit radoaktiv markiertem Noradrenalin bzw. Dopamin inkubiert. Anschließend wurde in Transmitterfreisetzungsexperimenten mit den so behandelten Gehirnschnitten Konzentrations-Wirkungskurven mit verschiedenen Liganden erstellt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, daß neben den alpha2A-AR auch alpha2C-AR pr{\"a}synaptisch die Transmitterfreisetzung von Noradrenalin und Dopamin hemmen. In einem weiteren Schritt wurde die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der alpha2A- und alpha2C-AR im heterologen Expressionssystem untersucht. Hierzu wurden stabile HEK293-Zellinien generiert, die entweder alpha2A- oder alpha2C-AR unterschiedlich stark exprimierten. Diese Zellinien wurden transient mit GIRK-Kan{\"a}len transfiziert, um die durch Stimulation mit Noradrenalin resultierenden Kaliumstr{\"o}me mit der "patch-clamp"-Technik zu messen. Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen alpha2A- und alpha2C-AR bez{\"u}glich der Aktivierungskinetik. Alpha2C-AR deaktivierten jedoch deutlich langsamer als alpha2A-AR. Diese Befunde belegen, daß zwei der drei alpha2-AR-Subtypen, alpha2A und alpha2C, als pr{\"a}synaptische Autorezeptoren (Noradrenalin) bzw. Heterorezeptoren (Dopamin) die Neurotransmission modulieren. Dies k{\"o}nnte in der Zukunft f{\"u}r die Entwicklung neuer, subtypspezifischer Pharmaka von großer Bedeutung sein.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gehrig2003,
  author    = {Gehrig, Andrea},
  title     = {Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Heredit{\"a}re Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auff{\"a}llig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufkl{\"a}rung der genetischen Ursachen einiger ausgew{\"a}hlter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgekl{\"a}rt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte f{\"u}r 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine h{\"a}ufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge M{\"a}nner weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Ver{\"a}nderungen der zentralen Retina f{\"u}hren. Ungef{\"a}hr 50 \% der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit {\"o}ffentlich zug{\"a}nglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert f{\"u}r ein putatives 224 Aminos{\"a}uren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindom{\"a}nen-Motiv enth{\"a}lt. Discoidindom{\"a}nen sind in Zelladh{\"a}sion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten best{\"a}tigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die {\"u}ber Disulfidbr{\"u}cken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfl{\"a}che der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der {\"a}ußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell f{\"u}r die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren f{\"u}hren. Gegenw{\"a}rtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgef{\"u}hrt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß dar{\"u}ber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein m{\"o}glicher Therapieansatz f{\"u}r RS auch beim Menschen sein k{\"o}nnte.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{GarciaArguinzonis2003,
  author    = {Garc{\´i}a Arguinzonis, Ma{\´i}sa In{\´e}s},
  title     = {Analysis of signal transduction pathways and the cytoskeleton in VASP-deficient cell lines and mouse models},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6195},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {The mammalian Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) is a founding member of the Ena/VASP family of proteins that includes Drosophila Enabled (ena), the mammalian Ena homologue (Mena) and the Ena-VASP-like protein (Evl). VASP was initially discovered and characterized as a substrate for cGMP- and cAMP-dependent protein kinases (cGKs and cAKs). Ena/VASP proteins are involved in Actin-filament formation, plasma membrane protrusion, acceleration of Actin-based motility of Listeria and the establishment of cell-cell adhesion. Moreover, Ena/VASP proteins have been implicated as inhibitory factors in repulsive axon guidance and inhibition of plasma membrane activity and random motility in fibroblast. In order to study the physiological function of VASP, VASP-deficient mice had been generated in the laboratory by homologous recombination. VASP-/- mice showed hyperplasia of megakaryocytes in the bone marrow and spleen and a two-fold increase in thrombin- and collagen-induced platelet activation. To further investigate the cellular function of VASP, I established cardiac fibroblast cell lines derived from both wild type and VASP-/- mice. Both cell lines presented similar growth rates and normal contact dependent-growth inhibition but showed differences in morphology, migration and adhesion. Adherent VASP-/- cells, despite normal Mena and Evl expression levels, were highly spread. VASP-/- cells covered about twice the substrate surface area as wild type cells, while the cell volumes were unchanged. This shape difference suggests that VASP is involved in the regulation of spreading. Since the small GTPases Rac and Cdc 42 and their effector p21-activated kinase (Pak) are key regulators of lamellipodia formation and cell spreading, I analyzed this signalling pathway in VASP-/- cells stimulated with Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) or fetal calf serum. In wild type cells Rac and Pak were rapidly and transiently activated by PDGF or serum; however, in the absence of VASP both Rac and Pak activation was dramatically prolonged. The Rac/Pak pathway is known to play an essential role in cell motility. VASP deficient cells showed compromised migration and reorientation in a wound healing assay, probably due to enhanced Rac activity. The spreading phenotype, compromised migration and the effect observed on the Rac and Pak activities were reverted in VASP-/- cells stably transfected with full lenght human VASP, indicating a VASP dependent modulation of the Rac/Pak pathway and Rac/Pak regulated processes. Moreover, adhesion and detachment of VASP-deficient cells were significantly slower when compared to wild type cells. Preincubation of VASP+/+ cells with a cGMP analog accelerated adhesion. This acceleration did not take place in the VASP-/- cells, suggesting a VASP dependent effect. The second part of this work focused on VASP function in platelets. On the one hand I investigated the possibility of VASP-dependent Rac regulation in mouse platelets. Murine platelets are a good model for studying Rac regulation since they express high levels of VASP but not Mena/Evl and since VASP-deficient platelets show an increased platelet activation. Rac was activated by platelet agonists which was inhibited by preincubation with cGMP and cAMP analogs. Initial results which need to be extended showed that the cGMPcaused inhibition of Rac activation was VASP-dependent. Finally, in vivo platelet adhesion (platelet-vessel wall interactions) was studied using VASP-deficient mice. These studies demonstrated in-vivo that VASP down regulates platelet adhesion to the vascular wall under both physiological and pathophysiological conditions.},
  subject      = {Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schulte2003,
  author    = {Schulte, Valerie},
  title     = {In vitro and in vivo studies on the activating platelet collagen receptor glycoprotein VI in mice},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6564},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {The work summarized here focused on the characterization of the murine platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI and was performed to evaluate its potential as an antithrombotic target. The first mAb against (mouse) GPVI, JAQ1, was generated and used to demonstrate that GPVI requires the FcRgamma-chain for its expression and function and that this receptor is the central molecule in collagen-induced platelet activation. Blocking the major collagen binding site on GPVI with JAQ1 revealed the presence of a second activatory epitope within collagen. Additionally, the collagen receptor integrin alpha2beta1 was found to be required for activation via this second pathway but not to be essential for collagen-induced activation of normal platelets. In studies with mice expressing reduced levels of the GPVI-FcRgamma-complex, differential responses to GPVI ligands were observed. Most importantly, the striking difference between platelet responses to collagen and the GPVI specific synthetic collagen related peptide (CRP) confirmed the supportive role of other collagen receptor(s) on platelets. Irrespective of yet undefined additional receptors, studies with mice deficient in GPVI (FcRgamma-chain) or alpha2beta1 showed that GPVI, but not alpha2beta1 is essential for platelet-collagen interaction. Based on these results, the model of platelet attachment to collagen was revised establishing GPVI as the initial activating receptor which upregulates the activity of integrins, thus enabling firm attachment of platelets to the ECM. While the mAb JAQ1 had only limited inhibitory effects on collagen-induced activation in vitro, its in vivo application to mice resulted in completely abolished platelet responses to collagen and the GPVI specific agonists CRP and convulxin. This effect was found to be due to antibody-induced irreversible down-regulation of GPVI on circulating platelets for at least two weeks. Further studies revealed that GPVI depletion occurs independently of the targeted epitope on the receptor and does not require the divalent form of IgG as it was also induced by mAbs (JAQ2, JAQ3) or the respective Fab fragments directed against epitopes distinct from the major collagen binding site. The internalization of GPVI in vivo resulted in a long-term protection of the mice from lethal collagen-dependent thromboembolism whereas it had only moderate effects on the bleeding time, probably because the treatment did not affect other activation pathways. These results establish GPVI as a potential pharmacological target for the prevention of ischemic cardiovascular diseases and may open the way for a completely new generation of antithrombotics.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Treichel2003,
  author    = {Treichel, Dieter},
  title     = {Isolierung, evolutive Einordnung und funktionelle Charakterisierung von Knopfkopf, einem buttonhead-Ortholog in der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5867},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist f{\"u}r die Entwicklung der Extremit{\"a}ten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekund{\"a}ren Gastrulation.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Philipp2002,
  author    = {Philipp, Melanie},
  title     = {Die Rolle von alpha2-adrenergen Rezeptoren w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5186},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, geh{\"o}ren zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute {\"u}ber alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten M{\"a}usen, sogenannten „Knock-Out"-M{\"a}usen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient f{\"u}r alpha2A und alpha2B, f{\"u}r alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. W{\"a}hrend alpha2AB-KO-M{\"a}use ungef{\"a}hr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-M{\"a}use teilweise und alpha2ABC-KO-M{\"a}use sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalit{\"a}t der alpha2ABC-KO-M{\"a}use auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalit{\"a}t in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begr{\"u}ndet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit N{\"a}hrstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit f{\"u}r dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS f{\"u}r alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, n{\"a}mlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dotters{\"a}cken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, w{\"a}hrend andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden k{\"o}nnen, nicht beeintr{\"a}chtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dotters{\"a}cken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dotters{\"a}cken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus {\"u}ber eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen.},
  subject      = {Maus},
  language  = {de}
}