@phdthesis{Woelke2010,
  author    = {W{\"o}lke, Stefan},
  title     = {Funktionelle Analyse von bakteriellen W-xxx-E Rho GTPasen GEF Mimetika mittels Typ 3 Sekretionssystems von Yersinia enterocolitica},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55010},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Die zellul{\"a}ren Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorg{\"a}nge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrit{\"a}t. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenit{\"a}tsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie geh{\"o}renden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden {\"u}ber ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox" f{\"u}hrte. Damit k{\"o}nnen heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zun{\"a}chst die Gene f{\"u}r die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminos{\"a}urereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kultur{\"u}berstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivit{\"a}t der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles" (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes" (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der St{\"a}mme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-St{\"a}mme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen l{\"a}sst, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP f{\"u}r RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse best{\"a}tigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abh{\"a}ngig Membranporen-bedingte Zellsch{\"a}digungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernf{\"a}rbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembransch{\"a}digung / Zytotoxizit{\"a}t nachgewiesen werden, nicht aber mit den St{\"a}mmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verst{\"a}rkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrit{\"a}t {\"u}ber Adh{\"a}sionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-St{\"a}mmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Sch{\"a}digung der Zellschichtintegrit{\"a}t f{\"u}hrt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unver{\"a}ndert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu k{\"o}nnen und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden M{\"a}use mit deletierten Genen f{\"u}r RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt.},
  subject      = {Actin},
  language  = {de}
}