@phdthesis{Zilian2014,
  author    = {Zilian, David},
  title     = {Neuartige, empirische Scoring-Modelle f{\"u}r Protein-Ligand-Komplexe und computergest{\"u}tzte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Techniken des computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schl{\"u}sselrolle im strukturbasierten computergest{\"u}tzen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zun{\"a}chst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergr{\"o}ßern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex besch{\"a}ftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivit{\"a}t klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich {\"u}berlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im n{\"a}chsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinit{\"a}ten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivit{\"a}t der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verf{\"u}gbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repr{\"a}sentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings erm{\"o}glicht. F{\"u}r die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der gr{\"o}ßten, die bisher f{\"u}r die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datens{\"a}tze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten f{\"u}r beide Datens{\"a}tze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datens{\"a}tzen zeigt - ein Ph{\"a}nomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datens{\"a}tze ergab dar{\"u}ber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie {\"u}ber die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor f{\"u}r die protein-abh{\"a}ngigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verl{\"a}ssliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums m{\"o}glich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans{\"a}tze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' f{\"u}r die SFCscore-Funktionen definieren l{\"a}sst. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zus{\"a}tzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverl{\"a}sslichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgesch{\"a}tzt werden k{\"o}nnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt f{\"u}r weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren f{\"u}r das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur f{\"u}r die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Dom{\"a}nen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zun{\"a}chst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erkl{\"a}rt werden. F{\"u}r die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Dom{\"a}nen-System, dass verschiedene allostere Zust{\"a}nde einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilit{\"a}t auf die Stabilit{\"a}t der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen f{\"u}r das Protein durchgef{\"u}hrt. Diese zeigen, dass das Protein tats{\"a}chlich eine {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Dom{\"a}nen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgef{\"u}hrten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise daf{\"u}r gefunden werden, dass die Mutationen, welche die f{\"u}r die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilit{\"a}t des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Dom{\"a}nenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilit{\"a}t auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zuk{\"u}nftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verkn{\"u}pft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt f{\"u}r die Inhibtion des Proteins darstellt.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zellner2005,
  author    = {Zellner, Elisabeth},
  title     = {Wechselwirkungen zwischen Replikationsproteinen und Origin-DNA w{\"a}hrend Proliferation und terminaler Differenzierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15263},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Ein Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Fragestellung, ob beim {\"U}bergang von Proliferation zu Teilungsruhe und Differenzierung irreversible Ver{\"a}nderungen in der Zusammensetzung des pr{\"a}replikativen Komplexes auftreten. Ein daf{\"u}r geeignetes System ist die murine C2C12-Zell-Linie, die durch Kultivierung in Hungermedium zu Myotuben differenziert werden k{\"o}nnen. FACS-Analyse und BrdU-Einbau ergaben, dass in den Muskelzellen keine signifikante DNA-Synthese mehr stattfindet. Die Fluktuation von Replikationsproteinen wurde im Verlauf der terminalen Differenzierung untersucht. Gleiche Mengen an Kern- und Cytoplasma-Extrakten von proliferierenden, konfluenten und sich differenzierenden Zellen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunblot mit Antik{\"o}rpern gegen Replikationsproteine untersucht ORC1, CDC6, MCM6 und Geminin konnten nach 132 h nicht mehr detektiert werden, w{\"a}hrend ORC2, ORC3, MCM3, CDT1 und CDC45 zwar noch vorhanden waren, jedoch in geringerer Menge als in proliferierenden Zellen. Weiterhin wurde die Menge an Replikationsproteinen in durch Serummangel transient aus dem Zellzyklus ausgetretenen G0-Phase-Zellen und Zellen, die durch Serum reaktiviert wurden, untersucht. Die Replikationsproteine waren in quieszenten C2C12- und 3T3-Zellen gleichermaßen wie in den terminal differenzierten Zellen in verringerter Menge vorhanden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Restimulierung von quieszenten, nicht aber terminal differenzierten Zellen, die erneute Expression von Replikationsproteinen zur Folge hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Chromatin-Immunpr{\"a}zipitations-Experimente (ChIP) mit proliferierenden und terminal differenzierten C2C12-Zellen durchgef{\"u}hrt. Eine preRC-Assemblierungsstelle befindet sich im OBR-Bereich der murinen rRNA-Gene von -2519 bis -2152 (Fragment B). In proliferierenden C2C12-Zellen konnte die Bindung von ORC1-5, CDC6, CDT1, MCM3, MCM6, CDC45 und HP1\&\#61537; an Fragment B nachgewiesen werden. W{\"a}hrend der terminalen Differenzierung werden ORC1, CDC6, CDT1 und CDC45 von der preRC-Bindungsstelle entfernt, ORC2-5, MCM3, MCM6 und HP1\&\#61537; bleiben an Fragment B gebunden. Die Bindung von preRC-Proteinen an Fragment B sollte durch Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) in vitro detailliert untersucht werden. Dazu mussten zun{\"a}chst preRC-Proteine nativ aus dem Kernextrakt proliferierender FM3A-Zellen durch Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie angereichert werden. Proteine in den Fraktionen B4 bis B12 bilden einen DNA-Protein-Komplex mit Fragment B. Die ATP-Abh{\"a}ngigkeit der Bildung des DNA-Protein-Komplexes wurde nachgewiesen. Die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes erfolgt sequenzspezifisch an Fragment B. Durch Zugabe spezifischer Antik{\"o}rper gegen ORC3 und CDT1 zur Bindungsreaktion konnte die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung des DNA-Protein-Komplexes unabh{\"a}ngig von ATP-Hydrolyse erfolgt und dass Diadenosin-Tetraphosphat (Ap4A) die Bindung von preRC-Proteinen an die DNA nicht signifikant stimuliert. Zur Eingrenzung der preRC-Bindungsstelle wurden sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende partiell deletierte B-Fragmente eingesetzt. Mit den um 100 bp verk{\"u}rzten Fragmenten kann der DNA-Protein-Komplex weiterhin gebildet werden. Deletionen von 200 bp entweder vom 5´- oder 3´-Ende verhindern hingegen die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes. Auf einem 119 bp langen Fragment (-2365 bis -2247), das zentral in Fragment B gelegen ist, kann sich der DNA-Protein-Komplex in einer ATP-stimulierten Weise wiederum ausbilden. Die Analyse dieses Bereiches zeigte, dass sich darin zwei auff{\"a}llige 9 bp-Sequenzen (CTCGGGAGA) befinden, die im Abstand von 63 bp wiederholt werden (-2343 bis -2335; -2280 bis -2272) und die durch die 200 bp-Deletionen ganz oder teilweise eliminiert wurden. Durch ortsgerichtete Mutagenese mittels PCR wurden innerhalb dieser 9 bp-Wiederholungen die Basen C zu A, T zu G und umgekehrt ausgetauscht. In vier sukzessiven Klonierungen wurden je 4 bp ersetzt (S1 bis S4), wobei die erhaltenen Konstrukte als Ausgangs-DNA f{\"u}r die nachfolgende Klonierung dienten. Die Substitutionen S1, S2 und S3 beeintr{\"a}chtigten die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes im Wesentlichen nicht. Wurden jedoch 8 bp in beiden 9 bp-Wiederholungen ersetzt (S4), war die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes nahezu vollst{\"a}ndig inhibiert. S4 hat außerdem eine leichte reduzierte elektrophoretische Mobilit{\"a}t der proteinfreien DNA-Fragmente zur Folge. Vermutlich stellen die 9 bp-Sequenzen jedoch keine Konsensus-Sequenz f{\"u}r die Bindung der preRC-Proteine per se dar, sondern haben vielmehr Effekte auf die Ausbildung spezifischer Sekund{\"a}r-Strukturen, die wiederum das Binden der preRC-Proteine an diese Region im OBR der murinen rRNA-Gene erlauben k{\"o}nnten.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{YuStrzelczyk2023,
  author    = {Yu-Strzelczyk, Jing},
  title     = {Generation and Characterization of novel proteins for light-activated hyperpolarization of cell membranes},
  doi       = {10.25972/OPUS-26675},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-266752},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {The light-gated cation channel Channelrhodopsin-2 was discovered and characterized in 2003. Already in 2005/2006 five independent groups demonstrated that heterologous expression of Channelrhodopsin-2 is a highly useful and simply applicable method for depolarizing and thereby activating nerve cells. The application of Channelrhodopsin-2 revolutionized neuroscience research and the method was then called optogenetics. In recent years more and more light-sensitive proteins were successfully introduced as "optogenetic tools", not only in neuroscience. Optogenetic tools for neuronal excitation are well developed with many different cation-conducting wildtype and mutated channelrhodopsins, whereas for inhibition of neurons in the beginning (2007) only hyperpolarizing ion pumps were available. The later discovered light-activated anion channels (anion channelrhodopsins) can be useful hyperpolarizers, but only at low cytoplasmic anion concentration. For this thesis, I optimized CsR, a proton-pumping rhodopsin from Coccomyxa subellipsoidea, which naturally shows a robust expression in Xenopus laevis oocytes and plant leaves. I improved the expression and therefore the photocurrent of CsR about two-fold by N-terminal modification to the improved version CsR2.0, without altering the proton pump function and the action spectrum. A light pulse hyperpolarised the mesophyll cells of CsR2.0-expressing transgenic tobacco plants (N. tabacum) by up to 20 mV from the resting membrane potential of -150 to -200 mV. The robust heterologous expression makes CsR2.0 a promising optogenetic tool for hyperpolarization in other organisms as well. A single R83H point-mutation converted CsR2.0 into a light-activated (passive) proton channel with a reversal potential close to the Nernst potential for intra-/extra-cellular H+ concentration. This light-gated proton channel is expected to become a further useful optogenetic tool, e.g. for analysis of pH-regulation in cells or the intercellular space. Ion pumps as optogenetic tools require high expression levels and high light intensity for efficient pump currents, whereas long-term illumination may cause unwanted heating effects. Although anion channelrhodopsins are effective hyperpolarizing tools in some cases, their effect on neuronal activity is dependent on the cytoplasmic chloride concentration which can vary among neurons. In nerve cells, increased conductance for potassium terminates the action potential and K+ conductance underlies the resting membrane potential in excitable cells. Therefore, several groups attempted to synthesize artificial light-gated potassium channels but 2 all of these published innovations showed serious drawbacks, ranging from poor expression over lacking reversibility to poor temporal precision. A highly potassium selective light-sensitive silencer of action potentials is needed. To achieve this, I engineered a light-activated potassium channel by the genetic fusion of a photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, and a cAMP-gated potassium channel, SthK. Illumination activates bPAC to produce cAMP and the elevated cAMP level opens SthK. The slow diffusion and degradation of cAMP makes this construct a very light-sensitive, long-lasting inhibitor. I have successfully developed four variants with EC50 to cAMP ranging from 7 over 10, 21, to 29 μM. Together with the original fusion construct (EC50 to cAMP is 3 μm), there are five different light- (or cAMP-) sensitive potassium channels for researchersto choose, depending on their cell type and light intensity needs.},
  subject      = {Proteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wagner2003,
  author    = {Wagner, Nicole},
  title     = {Charakterisierung der Kernmembranproteine Lamin-B-Rezeptor und Bocksbeutel von Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7245},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Dom{\"a}nen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wagh2005,
  author    = {Wagh, Dhananjay Anil},
  title     = {"Bruchpilot" -molecular and functional characterization of a novel active zone protein at the Drosophila synapse},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14989},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Chemical neurotransmission is a complex process of central importance for nervous system function. It is thought to be mediated by the orchestration of hundreds of proteins for its successful execution. Several synaptic proteins have been shown to be relevant for neurotransmission and many of them are highly conserved during evolution- suggesting a universal mechanism for neurotransmission. This process has checkpoints at various places like, neurotransmitter uptake into the vesicles, relocation of the vesicles to the vicinity of calcium channels in order to facilitate Ca2+ induced release thereby modulating the fusion probability, formation of a fusion pore to release the neurotransmitter and finally reuptake of the vesicles by endocytosis. Each of these checkpoints has now become a special area of study and maintains its own importance for the understanding of the overall process. Ca2+ induced release occurs at specialized membrane structures at the synapse known as the active zones. These are highly ordered electron dense grids and are composed of several proteins which assist the synaptic vesicles in relocating in the vicinity of Ca2+ channels thereby increasing their fusion probability and then bringing about the vesicular fusion itself. All the protein modules needed for these processes are thought to be held in tight arrays at the active zones, and the functions of a few have been characterized so far at the vertebrate active zones. Our group is primarily interested in characterizing the molecular architecture of the Drosophila synapse. Due to its powerful genetics and well-established behavioural assays Drosophila is an excellent system to investigate neuronal functioning. Monoclonal antibodies (MABs) from a hybridoma library against Drosophila brain are routinely used to detect novel proteins in the brain in a reverse genetic approach. Upon identification of the protein its encoding genetic locus is characterized and a detailed investigation of its function is initiated. This approach has been particularly useful to detect synaptic proteins, which may go undetected in a forward genetic approach due to lack of an observable phenotype. Proteins like CSP, Synapsin and Sap47 have been identified and characterized using this approach so far. MAB nc82 has been one of the shortlisted antibodies from the same library and is widely used as a general neuropil marker due to the relative transparency of immunohistochemical whole mount staining obtained with this antibody. A careful observation of double stainings at the larval neuromuscular junctions with MAB nc82 and other pre and post-synaptic markers strongly suggested an active zone localization of the nc82 antigen. Synaptic architecture is well characterized in Drosophila at the ultrastructural level. However, molecular details for many synaptic components and especially for the active zone are almost entirely unknown. A possible localization at the active zone for the nc82 antigen served as the motivation to initiate its biochemical characterization and the identification of the encoding gene. In the present thesis it is shown by 2-D gel analysis and mass spectrometry that the nc82 antigen is a novel active zone protein encoded by a complex genetic locus on chromosome 2R. By RT-PCR exons from three open reading frames previously annotated as separate genes are demonstrated to give rise to a transcript of at least 5.5 kb. Northern blots produce a prominent signal of 11 kb and a weak signal of 2 kb. The protein encoded by the 5.5 kb transcript is highly conserved amongst insects and has at its N-terminus significant homology to the previously described vertebrate active zone protein ELKS/ERC/CAST. Bioinformatic analysis predicts coiled-coil domains spread all over the sequence and strongly suggest a function involved in organizing or maintaining the structure of the active zone. The large C-terminal region is highly conserved amongst the insects but has no clear homologues in veretebrates. For a functional analysis of this protein transgenic flies expressing RNAi constructs under the control of the Gal4 regulated enhancer UAS were kindly provided by the collaborating group of S.Sigrist (G\&\#1616;ttingen). A strong pan-neuronal knockdown of the nc82 antigen by transgenic RNAi expression leads to embryonic lethality. A relatively weaker RNAi expression results in behavioural deficits in adult flies including unstable flight and impaired walking behavior. Due to this peculiar phenotype as observed in the first knockdown studies the gene was named "bruchpilot" (brp) encoding the protein "Bruchpilot (BRP)" (German for crash pilot). A pan-neuronal as well as retina specific downregulation of this protein results in loss of ON and OFF transients in ERG recordings indicating dysfunctional synapses. Retina specific downregulation also shows severely impaired optomotor behaviour. Finally, at an ultrastructural level BRP downregulation seems to impair the formation of the characteristic T-shaped synaptic ribbons at the active zones without significantly altering the overall synaptic architecture (in collaboration with E.Asan). Vertebrate active zone protein Bassoon is known to be involved in attaching the synaptic ribbons to the active zones as an adapter between active zone proteins RIBEYE and ERC/CAST. A mutation in Bassoon results in a floating synaptic ribbon phenotype. No protein homologous to Bassoon has been observed in Drosophila. BRP downregulation also results in absence of attached synaptic ribbons at the active zones. This invites the speculation of an adapter like function for BRP in Drosophila. However, while Bassoon mutant mice are viable, BRP deficit in addition to the structural phenotype also results in severe behavioural and physiological anomalies and even stronger downregulation causes embryonic lethality. This therefore suggests an additional and even more important role for BRP in development and normal functioning of synapses in Drosophila and also in other insects. However, how BRP regulates synaptic transmission and which other proteins are involved in this BRP dependant pathway remains to be investigated. Such studies certainly will attract prominent attention in the future.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Tian2011,
  author    = {Tian, Rui},
  title     = {Structural and functional organization of synaptic proteins in Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57399},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Structural and functional modifications of synaptic connections ("synaptic plasticity") are believed to mediate learning and memory processes. Thus, molecular mechanisms of how synapses assemble in both structural and functional terms are relevant for our understanding of neuronal development as well as the processes of learning and memory. Synapses form by an asymmetric association of highly specialized membrane domains: at the presynaptic active zone transmitter filled vesicles fuse, while transmitter receptors at the opposite postsynaptic density sense this signal. By genetic analysis, matrix proteins of active zones from various families have been shown to be important for fast vesicle fusion, and were suggested to contribute to synapse stability and assembly. The Sigrist lab in collaboration with the Buchner lab previously had shown that the large scaffold protein Bruchpilot (Brp) is essential for both the structural and functional integrity of active zones and for synaptic plasticity in Drosophila melanogaster. The work described in this thesis investigated several candidate proteins which appear to be involved in preand postsynaptic function, as summarized in the following: (1) DREP-2 (DEF45 related protein-2) had been found by co-immunoprecipitations with anti-Brp antibodies by Dr. Manuela Schmidt (unpublished data). Mutants and antibodies for the further study of DREP- 2 were generated in this thesis. Yeast two hybrid results suggest that DREP-2 might interact with dynein light chain 2, while in vivo imaging indicates that DREP-2 might be involved in bidirectional axonal transport. (2) Coimmunoprecipitation and pull down experiments suggested that the ARFGAP [ADP-ribosylation factor (ARF)-directed GTPase activating protein (GAP)] protein GIT (G-protein coupled receptor kinase interacting protein) could interact with the endocytosis associated molecule Stoned B (StnB). Mutants in the dgit gene showed an accumulation of large size vesicles, membrane intermediates and decreased vesicle density at the 3rd instar larval neuromuscular junction (NMJ) by electron microscopy (EM). The phenotypes accumulation of large size vesicles and membrane intermediates could be rescued partially by expression of Drosophila GIT (DGIT) or human GIT in dgit mutant background. Furthermore, by immunofluorescence the dgit mutant shows specifically decreased levels of StnB, which could be restored partially by the expression of DGIT. These results strongly support the suggestion that DGIT interacts with StnB, which is involved in the regulation of vesicle size, endocytosis or recycling of synaptic vesicles (SVs). Furthermore, the dgit mutants also showed signs of a mislocalization of the presynaptic protein Brp relative to the postsynaptic protein GluRIID, which could be rescued by expression of DGIT or human GIT in the dgit mutant background, but not by StnB. These results suggest that GIT on one hand executes roles in the regulation of synaptic vesicle endocytosis, but potentially also has structural roles for synapse assembly (3) Djm-1 is a candidate locus to mediate mental retardation in human patients when it is mutated. As a first step towards an understanding of the mechanistic role of DJM-1, Drosophila genetics were used to address DJM-1 function. So far, however, the djm-1 mutant generated in this thesis did not show a nervous system phenotype.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Stuermer2004,
  author    = {St{\"u}rmer, Andrea},
  title     = {Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgel{\"o}st wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin f{\"u}r den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den pr{\"a}replikativen Komplex vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzukl{\"a}ren. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellul{\"a}ren Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-F{\"a}rbung mit Antik{\"o}rpern gegen eine konservierte Dom{\"a}ne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antik{\"o}rpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch f{\"u}r die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte {\"u}ber Immunpr{\"a}zipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin pr{\"a}zipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine w{\"a}hrend der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down" des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System erm{\"o}glicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte St{\"o}rung des Zellwachstums hin. Zus{\"a}tzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollst{\"a}ndig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen m{\"o}glichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auff{\"a}llig h{\"a}ufig lagen in MCM3-„knock-down"-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Ph{\"a}notypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukle{\"a}rer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down"-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des pr{\"a}replikativen Komplexes eine zus{\"a}tzliche Funktion in der Mitose aus{\"u}ben.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Strehle2003,
  author    = {Strehle, Marion A.},
  title     = {Mikroskopische und spektroskopische Charakterisierung biologisch relevanter Oberfl{\"a}chen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5775},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {In dieser Arbeit werden biologisch relevante Oberfl{\"a}chen untersucht, die in der Medizin bzw. in der Biologie eine wichtige Rolle spielen. Die Proteinadsorption auf Implantat-Oberfl{\"a}chen wurde charakterisiert, um wichtige Informationen {\"u}ber den Adsorptionsprozess zu erhalten. Das Fernziel hierbei ist, durch ein umfassendes Wissen {\"u}ber diesen f{\"u}r die Implantation wichtigen Schritt Biomaterialien mit m{\"o}glichst hoher Gewebevertr{\"a}glichkeit zu entwickeln. Die Verteilung von Propolis auf der Wachs-Oberfl{\"a}che von Bienenwaben wurde untersucht, um mehr {\"u}ber dessen Nutzen, der noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt ist, zu erfahren und um auf m{\"o}gliche Auswirkungen einer ver{\"a}nderten Wabenstruktur auf die Kommunikation der Honigbienen R{\"u}ckschl{\"u}sse ziehen zu k{\"o}nnen. Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war, das Adsorptionsverhalten der Proteine Fibrinogen, Albumin und Fibronektin auf Titandioxid, einem in der Medizin h{\"a}ufig als Implantat eingesetzten Material, zu studieren. Die Adsorption von Proteinen auf der Oberfl{\"a}che von Implantaten ist ein wichtiger Schritt f{\"u}r die Gewebevertr{\"a}glichkeit bzw. Biokompatibilit{\"a}t dieser Materialien. Es wurden sowohl die r{\"a}umliche Verteilung der Proteine auf den Implantat-Oberfl{\"a}chen als auch die durch die Adsorption hervorgerufenen strukturellen Ver{\"a}nderungen der Proteine untersucht. Als Methoden wurden hierf{\"u}r die Laser-Raster-Mikroskopie (LSM), die Kraftfeldmikroskopie (AFM) sowie die Raman-Spektroskopie eingesetzt. Durch ein umfassendes Wissen {\"u}ber den Adsorptionsprozess der Proteine auf Implantat-Materialien k{\"o}nnen die Oberfl{\"a}chen der Implantate dahingehend ver{\"a}ndert werden, dass es zu einer besseren Proteinadsorption und dadurch zu einer noch geringeren Rate an Abstoßungsreaktionen kommt. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse k{\"o}nnen einen Teil zum Verst{\"a}ndnis des Adsorptionsprozesses beitragen. Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, die chemische Zusammensetzung von Propolis (dem Kittharz der Bienen) und Wabenwachs von Apis mellifera carnica Pollm. sowie die r{\"a}umliche Verteilung von Propolis auf den Waben-Oberfl{\"a}chen zu untersuchen. Hierzu wurden die Raman-Spektroskopie und Raman-Mapping eingesetzt. Es wurden zun{\"a}chst Raman-Spektren von Propolis-Proben sowie Raman-Spektren von charakteristischen Standardsubstanzen des Propolis aufgenommen. Das Propolis-Spektrum sowie das Wachs-Spektrum wurden durch eine Auswahl an Standardsubstanzen simuliert. Um herauszufinden, welche Harze von den Bienen gesammelt und als Propolis im Stock verwendet werden, wurden von einigen Harzen, die als Propolis-Quellen in Betracht kommen, Raman-Spektren aufgenommen. Es wurde auch analysiert, ob die Kettenl{\"a}ngen der Alkane, aus denen die Wachse bestehen, einen Einfluss auf die Raman-Spektren hat. Mittels Raman-Mapping wurde schließlich die r{\"a}umliche Verteilung von Propolis auf der Waben-Oberfl{\"a}che untersucht. Die hier charakterisierten biologisch relevanten Oberfl{\"a}chen spielen eine wichtige Rolle in der Medizin und in der Biologie. Die Analyse mit mikroskopischen und spektroskopischen Methoden verschafft einen Einblick in die Prozesse, die sich an diesen Oberfl{\"a}chen abspielen. Die Proteinadsorption auf Implantat-Oberfl{\"a}chen sind f{\"u}r die Implantationsmedizin von Bedeutung. Es werden st{\"a}ndig neue Materialien entwickelt, die eine m{\"o}glichst gute Biokompatibilit{\"a}t aufweisen sollen. Erkenntnisse {\"u}ber die Prozesse, die hierf{\"u}r eine Rolle spielen, helfen bei der Entwicklung neuer Materialien. Die Verteilung von Propolis auf den Wachs-Oberfl{\"a}chen hat einen Einfluss auf die Materialbeschaffenheit der Waben. Dies k{\"o}nnte die Vibrationsweiterleitung beim Schw{\"a}nzeltanz der Honigbienen, der f{\"u}r deren Kommunikation von Bedeutung ist, beeinflussen. Die Verteilung des Propolis auf den Waben konnte f{\"u}r kleine Ausschnitte gezeigt werden. Inwiefern eine Propolisschicht auf den Stegen der Waben die Vibrationsweiterleitung tats{\"a}chlich beeinflusst, muss durch weiterf{\"u}hrende Experimente herausgefunden werden.},
  subject      = {Implantat},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Shityakov2011,
  author    = {Shityakov, Sergey},
  title     = {Molecular modelling and simulation of retroviral proteins and nanobiocomposites},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56960},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Molecular modelling and simulation are powerful methods in providing important in-formation on different biological systems to elucidate their structural and functional proper-ties, which cannot be determined in experiment. These methods are applied to analyse versa-tile biological systems: lipid membrane bilayers stabilized by an intercalated single wall carbon nanotube and retroviral proteins such as HIV protease and integrase. HIV-1 integrase has nuclear localization signals (NLS) which play a crucial role in nuclear import of viral preintegration complex (PIC). However, the detailed mechanisms of PIC formation and its nuclear transport are not known. Previously it was shown that NLSs bind to the cell transport machinery e.g. proteins of nuclear pore complex such as transportins. I investigated the interaction of this viral protein HIV-1 integrase with proteins of the nuclear pore complex such as transportin-SR2 (Shityakov et al., 2010). I showed that the transportin-SR2 in nuclear import is required due to its interaction with the HIV-1 integrase. I analyzed key domain interaction, and hydrogen bond formation in transportin-SR2. These results were discussed in comparison to other retroviral species such as foamy viruses to better understand this specific and efficient retroviral trafficking route. The retroviral nuclear import was next analyzed in experiments regarding the retroviral ability to infect nondividing cells. To accomplish the gene transfer task successfully, ret-roviruses must efficiently transduce different cell cultures at different phases of cell cycle. However, promising and safe foamy viral vectors used for gene transfer are unable to effi-ciently infect quiescent cells. This drawback was due to their inability to create a preintegra-tion complex (PIC) for nuclear import of retroviral DNA. On the contrary, the lentiviral vec-tors are not dependant on cell cycle. In the course of reverse transcription the polypurine tract (PPT) is believed to be crucial for PIC formation. In this thesis, I compared the transduction frequencies of PPT modified FV vectors with lentiviral vectors in nondividing and dividing alveolar basal epithelial cells from human adenocarcinoma (A549) by using molecular cloning, transfection and transduction techniques and several other methods. In contrast to lentiviral vectors, FV vectors were not able to effi-ciently transduce nondividing cell (Shityakov and Rethwilm, unpublished data). Despite the findings, which support the use of FV vectors as a safe and efficient alternative to lentiviral vectors, major limitation in terms of foamy-based retroviral vector gene transfer in quiescent cells still remains. Many attempts have been made recently to search for the potential molecules as pos-sible drug candidates to treat HIV infection for over decades now. These molecules can be retrieved from chemical libraries or can be designed on a computer screen and then synthe-sized in a laboratory. Most notably, one could use the computerized structure as a reference to determine the types of molecules that might block the enzyme. Such structure-based drug design strategies have the potential to save off years and millions of dollars compared to a more traditional trial-and-error drug development process. After the crystal structure of the HIV-encoded protease enzyme had been elucidated, computer-aided drug design played a pivotal role in the development of new compounds that inhibit this enzyme which is responsible for HIV maturation and infectivity. Promising repre-sentatives of these compounds have recently found their way to patients. Protease inhibitors show a powerful sustained suppression of HIV-1 replication, especially when used in combi-nation therapy regimens. However, these drugs are becoming less effective to more resistant HIV strains due to multiple mutations in the retroviral proteases. In computational drug design I used molecular modelling methods such as lead ex-pansion algorithm (Tripos®) to create a virtual library of compounds with different binding affinities to protease binding site. In addition, I heavily applied computer assisted combinato-rial chemistry approaches to design and optimize virtual libraries of protease inhibitors and performed in silico screening and pharmacophore-similarity scoring of these drug candidates. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease bind-ing ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is dis-cussed (Shityakov and Dandekar, 2009). A number of atomistic models were developed to elucidate the nanotube behaviour in lipid bilayers. However, none of them provided useful information for CNT effect upon the lipid membrane bilayer for implementing all-atom models that will allow us to calculate the deviations of lipid molecules from CNT with atomistic precision. Unfortunately, the direct experimental investigation of nanotube behaviour in lipid bilayer remains quite a tricky prob-lem opening the door before the molecular simulation techniques. In this regard, more de-tailed multi-scale simulations are needed to clearly understand the stabilization characteristics of CNTs in hydrophobic environment. The phenomenon of an intercalated single-wall carbon nanotube in the center of lipid membrane was extensively studied and analyzed. The root mean square deviation and root mean square fluctuation functions were calculated in order to measure stability of lipid mem-branes. The results indicated that an intercalated carbon nanotube restrains the conformational freedom of adjacent lipids and hence has an impact on the membrane stabilization dynamics (Shityakov and Dandekar, 2011). On the other hand, different lipid membranes may have dissimilarities due to the differing abilities to create a bridge formation between the adherent lipid molecules. The results derived from this thesis will help to develop stable nanobiocom-posites for construction of novel biomaterials and delivery of various biomolecules for medi-cine and biology.},
  subject      = {Kohlenstoff},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schaafhausen2011,
  author    = {Schaafhausen, Anne},
  title     = {Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Seit der Entdeckung des ersten Gens f{\"u}r den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schl{\"u}ssel-Enzym f{\"u}r die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zus{\"a}tzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anf{\"a}llt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen f{\"u}hren zu einem signifikanten Effekt auf die ben{\"o}tigte Coumarin-Dosis und die Stabilit{\"a}t der H{\"a}mostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1" (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit v{\"o}llig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellul{\"a}ren Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein k{\"o}nnen. Die Ergebnisse k{\"o}nnen wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke {\"A}hnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivit{\"a}t, wobei die Affinit{\"a}ten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich h{\"o}her sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen f{\"u}hrt in beiden Proteinen zu einem fast vollst{\"a}ndigen Verlust der Aktivit{\"a}t. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 - wie VKORC1 - in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine {\"a}hnliche Struktur, die gleiche zellul{\"a}re Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivit{\"a}t hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen k{\"o}nnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out M{\"a}usen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem f{\"u}r Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als K{\"o}der 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferh{\"a}ufigkeit und funktioneller {\"U}berlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation n{\"a}her untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke {\"U}berschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies k{\"o}nnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, f{\"u}hrt aber auch zu neuen Hypothesen bez{\"u}glich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1" (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals W{\"u}rzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein" (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP f{\"u}hren zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die {\"A}hnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch {\"u}berh{\"o}hte Dosierung von Coumarinen w{\"a}hrend der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpr{\"a}zipitationsexperimenten nicht best{\"a}tigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bed{\"u}rfen weiterf{\"u}hrender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen w{\"a}re auch eine kritische Betrachtung der {\"u}brigen 85 prim{\"a}ren Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.},
  subject      = {Vitamin-K-Gruppe},
  language  = {de}
}