@phdthesis{Rosel2007,
  author    = {Rosel, Eva Annemarie},
  title     = {Die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) in der Endothelaktivierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27824},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) f{\"u}r die Endothelaktivierung. F{\"u}r diese Untersuchungen wurde die MLEC-Zellkulturtechnik (murine lung endothelial cells) und die Gegen{\"u}berstellung des Wiltyp- und eNOS-Knockout-Genotyps verwendet. Die MLEC-Kulturen wurden aus dem mikrovaskul{\"a}ren Stromgebiet der Lungen von C57Bl6-Wildtyp-M{\"a}usen (WT) und von eNOS-Knockout-M{\"a}usen (KO) angelegt und immunomagnetisch (Anti-CD102) zweifach selektioniert. Die Reinheit der Kulturen f{\"u}r Endothelzellen nach zwei Selektionen lag bei {\"u}ber 95\%. WT-Endothelzellen produzieren eine basale Menge an Stickstoff-Monoxid (NO). Sie steigern ihre NO-Produktion nach Stimulation mit VEGF (vascular endothelium growth factor), mit dem Kalzium-Ionophor Ionomycin sowie unter Scherkraftexposition. Die eNOS-Proteinexpression erh{\"o}ht sich dementsprechend nach 12 Stunden Scherkraftexposition. WT- und eNOS-KO-Endothelzellen unterscheiden sich unter basalen Bedingungen nicht in ihrer Oberfl{\"a}chenexpression der Adh{\"a}sionsmolek{\"u}le ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin und VCAM-1. Nach Zytokin-Stimulation erh{\"o}hen beide Genotypen ihr Adh{\"a}sionsmolek{\"u}lprofil in gleicher Weise. Sowohl WT- als auch eNOS-KO-Endothelzellen verf{\"u}gen zudem {\"u}ber einen schnellen Mechanismus, der die Hochregulation der P-Selektin-Oberfl{\"a}chenexpression nach Stimulation mit Thrombin oder Menadion in gleicher Weise erm{\"o}glicht. Auf Stimulation mit Thrombin oder Menadion reagieren WT-Zellen mit einem signifikanten Anstieg der Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen (ROS, rapid oxygen species). eNOS-KO-Zellen zeigen eine im Vergleich zum WT erh{\"o}hte basale ROS-Produktion. Diese l{\"a}sst sich auch nach Stimulation nicht weiter steigern. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die MLEC-Zellkulturtechnik ein verl{\"a}ssliches Modell f{\"u}r Untersuchungen an Gef{\"a}ßendothelzellen darstellt. eNOS-KO-Zellen exprimieren nicht automatisch mehr Adh{\"a}sionsmolek{\"u}le an der Zelloberfl{\"a}che als WT-Zellen. Allerdings ist die basale Produktion von ROS in eNOS-KO-Zellen vermehrt. Folglich ist in diesem Modell eNOS nicht f{\"u}r die konstitutive Suppression der endothelialen Aktivierung verantwortlich. Der NO-Effekt kann nicht in einer direkten und kontinuierlichen Unterdr{\"u}ckung der endothelialen Oberfl{\"a}chenaktivierung liegen. Das Fehlen von NO f{\"u}hrt vielmehr zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem Radikalf{\"a}nger NO und O2- (Superoxid) zugunsten von O2-. Aufgrund dieses Ungleichgewichts ist die basale ROS-Produktion von eNOS-KO-Zellen vermutlich erh{\"o}ht. Damit wird die Endothelzelle empfindlicher gegen{\"u}ber zus{\"a}tzlichem oxidativen Stress. Die eNOS-KO-Zellen k{\"o}nnen die h{\"o}here ROS-Belastung in den durchgef{\"u}hrten Untersuchungen kompensieren. Es ist aber denkbar, dass bei zus{\"a}tzlichem oxidativen Stress ein erh{\"o}htes Maß an O2- das Startsignal f{\"u}r die Abl{\"a}ufe der endothelialen Aktivierung darstellt.},
  subject      = {Stickstoffmonoxid},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schmalfuss2006,
  author    = {Schmalfuss, Andreas},
  title     = {Protonensensitivit{\"a}t des Hitzerezeptors von prim{\"a}r afferenten Neuronen der K{\"u}ken in vitro},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24973},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Aus vorherigen Ver{\"o}ffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der S{\"a}ugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivit{\"a}t und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen k{\"o}nnten R{\"u}ckschl{\"u}sse auf funktionelle Strukturen des S{\"a}ugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die {\"u}bergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivit{\"a}t unterscheiden. F{\"u}r die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von K{\"u}ken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgef{\"u}hrt, um eine m{\"o}gliche Ver{\"a}nderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierf{\"u}r wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinw{\"a}rtsstr{\"o}men untersucht. Zun{\"a}chst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabh{\"a}ngig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die n{\"a}chste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierf{\"u}r wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3\% ± 0,5\% bei pH 7,4 auf 35,0\% ± 4,0\% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabh{\"a}ngig ist. Hierf{\"u}r wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgef{\"u}hrt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einw{\"a}rtsstr{\"o}me gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einw{\"a}rtsstroms temperaturabh{\"a}ngig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einw{\"a}rtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der K{\"u}ken TRPV1 {\"a}hnlich wie der der S{\"a}ugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entz{\"u}ndlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verst{\"a}rkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone.},
  subject      = {K{\"u}ken},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kroiss2006,
  author    = {Kroiß, Matthias},
  title     = {Die subzellul{\"a}re Verteilung des Regulatorproteins RS1 in Nierenepithelzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20712},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazellul{\"a}re Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antik{\"o}rper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden daf{\"u}r erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellul{\"a}r an Vesikeln sowie an einem perinukle{\"a}ren Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukle{\"a}ren Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde {\"u}berwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erh{\"o}ht und gegenl{\"a}ufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit fr{\"u}her gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schl{\"u}ssigen Konzept zusammenf{\"u}hrt.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kerscher2006,
  author    = {Kerscher, Alexander Georg},
  title     = {Entwicklung einer mikroskopierbaren Perfusions-Kulturkammer f{\"u}r die Kultivierung, die In-Vitro-Vitalit{\"a}ts- und die Funktionsdiagnostik von endokrinen Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20282},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Als Therapie des Diabetes mellitus Typ II stellt die Xenotransplantation von porzinen Langerhans-Inseln in mikroverkapselter Form eine attraktive Alternative zu den t{\"a}glichen Insulininjektionen dar. Kultivierung und Funktionsdiagnostik der isolierten porzinen Langerhans-Inseln sind technisch anspruchsvoll und bieten noch immer Potential f{\"u}r Verbesserungen. Werden die Zellen in Zellkulturflaschen {\"u}ber mehrere Tage kultiviert, sinkt die Vitalit{\"a}t unter ein akzeptables Niveau. Bei der Beurteilung der Vitalit{\"a}t und Funktion der Inseln gehen wertvolle Zellen f{\"u}r eine sp{\"a}tere Transplantation verloren. Dies schr{\"a}nkt eine ausgiebige Diagnostik vor der Transplantation ein. Ziel der Arbeit ist es, eine M{\"o}glichkeit zur Verbesserung der Kulturbedingungen zu finden und exakte Ergebnisse bei der Funktions- und Vitalit{\"a}tsdiagnostik ohne Verlust von Zellen zu erreichen. Vorversuche konnten beweisen, dass eine Verbesserung der Vitalit{\"a}t von Langerhans-Inseln in Kultur an der Methode der Kultivierung in Zellkulturflaschen scheitert. Stattdessen wurde das Prinzip der Perfusionskultur in spezialisierten Beh{\"a}ltnissen f{\"u}r die systematische Verbesserung der Kulturbedingungen und zur genaueren Diagnostik mittels Mikroskopie und Funktionsdiagnostik gew{\"a}hlt. Mit einem solchen System ist sowohl Kultivierung als auch Funktions- und Vitalit{\"a}tsdiagnostik in einem Beh{\"a}lter m{\"o}glich. Beim Prinzip der Perfusionskultur befindet sich das Medium stets in Bewegung um die Zellen und Gewebe und sorgt so f{\"u}r einen kontinuierlichen Zustrom exakt definierten Mediums und permanenten Abtransport der Stoffwechselprodukte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde f{\"u}r die Anforderungen im eigenen Labor ein maßgeschneidertes System mit mehreren Versionen von Beh{\"a}ltnissen f{\"u}r Perfusionskulturen entwickelt, deren jeweils neuere Version auf den Erfahrungen mit den Vorversionen aufbaut. In die Entwicklung fließen ebenso umfangreiche theoretische {\"U}berlegungen ein, sowie systematische Tests zu den physikalischen Eigenschaften der Beh{\"a}ltnisse. Die zuletzt entwickelte ist die Version V6SMTE, die in der Arbeit „W{\"u}rzburger Kammer" genannt wird. Dieser Beh{\"a}lter ist aus Edelstahl, mit einem Deckglas zur makro- und mikroskopischen Begutachtung, Zu- und Abl{\"a}ufen und einem Anschluss zum Entfernen von Gasblasen. Im Inneren befindet sich ein Einsatz, der eine stufenlose Regulierung des Volumens um die Zellen erm{\"o}glicht, so dass f{\"u}r Kultur und Funktionspr{\"u}fung bzw. Mikroskopie jeweils optimale Bedingungen erreicht werden. Weiterhin kann {\"u}ber einen Temperatursensor die Temperatur im Inneren des Beh{\"a}lters gemessen und {\"u}ber Heizelemente an der Außenwand computergesteuert reguliert werden. Die Zellen und Gewebe k{\"o}nnen auf unterschiedlichen Tr{\"a}germaterialien eingesetzt werden. W{\"a}hrend der Kultur kann ein Deckel ge{\"o}ffnet und die Zellen manipuliert werden. Das System ist unabh{\"a}ngig vom Brutschrank, ist sterilisierbar und wieder verwendbar. Kultiviert wurde endokrines Gewebe (isolierte Langerhans-Inseln, humanes Nebenschilddr{\"u}sengewebe). Dieses wurde zur Funktionspr{\"u}fung mit verschiedenen Mediatoren stimuliert, das Medium fraktioniert aufgefangen und sein Hormongehalt mit ELISA oder RIA bestimmt. Die Zellen wurden nativ und mit Fluoreszenzfarbstoffen (FDA, PI) gef{\"a}rbt mit bis zu 400facher Vergr{\"o}ßerung unter dem Auflichtmikroskop beurteilt. Im Zuge der Auswertung der anfallenden Proben auf ihren Insulingehalt wurde f{\"u}r diese Arbeit ein Insulin-ELISA entwickelt, der bei vergleichbarer Genauigkeit deutlich g{\"u}nstiger ist, als der bisher verwendete kommerzielle ELISA. Mit der W{\"u}rzburger Kammer kultivierte Langerhans-Inseln zeigten eine vergleichbare Vitalit{\"a}t im Vergleich zur Zellkulturflasche, die mit der W{\"u}rzburger Kammer gewonnenen Perifusionskurven sind in hohem Maß reproduzierbar, Zusammenh{\"a}nge von H{\"o}he der Glukoseexposition und Kultivierungsdauer mit der Insulinaussch{\"u}ttungskurve konnten eindrucksvoll beschrieben werden. Erstmals wurde auch im eigenen Labor die aus der Literatur bekannte paradoxe Insulinaussch{\"u}ttung beschrieben. Beispielhaft f{\"u}r andere endokrine Gewebe wurde humanes Nebenschilddr{\"u}sengewebe erfolgreich in der W{\"u}rzburger Kammer kultiviert und Vitalit{\"a}ts- und Funktionsdiagnostik unterzogen. Das Kultursystem erm{\"o}glicht die Kultivierung und eine komplette Analyse von Funktion, Vitalit{\"a}t und Morphologie von endokrinen Zellen. Es kann somit in idealer Weise zur Verbesserung der Kulturbedingungen und zur Beurteilung von endokrinen Zellen vor der Transplantation herangezogen werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Li2004,
  author    = {Li, Jie},
  title     = {Differential effects of neuromelanin and synthetic dopamine melanin on cell lines},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13588},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {xxx},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Fach2004,
  author    = {Fach, Cornelia},
  title     = {Selektive Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung eines hypermutablen Bereiches des Fanconi-An{\"a}mie-A (FANCA)-Gens aus Fibroblasten-Kulturen unterschiedlicher Passagen und Genotypen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10464},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Fanconi-An{\"a}mie geh{\"o}rt zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilit{\"a}t aus. Die genomische Instabilit{\"a}t ist auch Ursache h{\"a}ufiger R{\"u}ckmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilit{\"a}t vor. Insbesondere gilt dies f{\"u}r das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilit{\"a}t aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als h{\"a}ufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplement{\"a}r einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. F{\"u}r die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine h{\"o}here Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kochel2004,
  author    = {Kochel, Michael},
  title     = {Tissue engineering von Knochen - Entwicklung eines Zweikreis-Perfusionssystems f{\"u}r die Langzeitkultivierung von Knochenzellen in einer dreidimensionalen Matrix},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8559},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die in vitro-Langzeitkultivierung von Zellen in einer Drei-Dimensionalen Matrix (3D-Matrix) stellt nach wie vor eine Herausforderung im Tissue engineering dar. Die Kultivierung von Zellen auf/in komplexen 3D-Tr{\"a}gern erfordert hohe Zellzahlen und lange Kulturzeiten. Um die Probleme des schnellen Mediumverbrauches und der limitierten Zellzahl bzw. Zelldichte in konventionellen Kulturmethoden zu umgehen, wurde ein „Zweikreis-Perfusionssystem" entwickelt. Hierzu wurde ein Cell-Pharm System (Cell-Pharm System 100®-Basisger{\"a}t) modifi-ziert. Das Grundprinzip des Systems besteht darin, dass ein kleinvolumiger (50-70 ml) „Zellkultur-Kreislauf" {\"u}ber einen Bioreaktor (semipermeable Hohlfasermembran) durch einen großvolumigen (1000 ml) „Regenerations-Kreislauf" kontinuierlich im Gegenstromprinzip regeneriert wird. Die Regulation des ph-Wertes und der Sauerstoffs{\"a}ttigung des Kulturmediums geschieht {\"u}ber einen integrierten, Druckluft-CO2-begasten Oxygenator. W{\"a}hrend die Zirkulationsgeschwindigkeit (Durchflussrate) und Temperatur (37°C) im Regenerations-Kreislauf konstant gehalten werden, lassen sich diese Parameter im „Zellkultur-Kreislauf" beliebig variieren. Es hat sich gezeigt, dass sich auf diese Weise kontinuierlich {\"u}ber einen langen Zeitraum ohne Mediumwechsel konstante und optimale Milieuverh{\"a}ltnisse in beiden Mediumkompartments einstellen lassen. Zur Untersuchung der Wachstumseigenschaften von Zellen in diesem Perfusions-system wurden humane osteoblasten{\"a}hnliche Zellen oder Ratten-Knochenmarkszellen auf eine Matrix aus demineralisierter, GuHCl-extrahierter Rinderspongiosa unterschiedlicher Gr{\"o}ße (Zylinder zwischen 5x3 mm und 5x10 mm) aufgetragen. Unter intermittierender Perfusion der Kulturkammern (z.B. Minucells cell container®) mit 50-70 ml/d kam es zu einem gleichm{\"a}ßigen, intertrabekul{\"a}ren Wachstum der Zellen innerhalb des gesamten Tr{\"a}gers. Nach 6-8 Wochen konnte immer noch ein dichtes Netz interdigitierender ALP-positiver osteoblasten{\"a}hnlicher Zellen innerhalb der gesamten Matrix beobachtet werden. Dabei scheint die physikalisch-mechanische Komponente der „Umsp{\"u}lung" der Zellen mit dem kontinuierlich regenerierten N{\"a}hrmedium einen positiven Einfluss auf das Anwachsverhalten und Proliferation der Zellen zu haben. Somit erlaubt das modifizierten „Zweikreisperfusionssystem" eine gute M{\"o}glichkeit f{\"u}r die Langzeitperfusionskultur in einem geschlossenen System mit indi-viduell steuerbaren Str{\"o}mungsverh{\"a}ltnissen im Zellkompartment bei einer kontinuierlichen Regeneration des Mediums.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Faltin2004,
  author    = {Faltin, Manuela},
  title     = {Proliferation und Differenzierung der Zellkultursysteme hFOB 1.19 und C3H10T1/2 - BMP-2 unter dem Einfluss von nichtsteroidaler Antiphlogistika und einzeitiger Radiatio},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7854},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Auswahl der Zellkulturmodelle hFOB 1.19 und C3H10T1/2 - BMP-2 erfolgte basierend auf den Hypothesen zur Entstehung heterotoper Ossifikationen. So kann die humane fetale Osteoblastenzell-Linie hFOB 1.19 in diesem Zusammenhang als determined osteoblastic progenitor cell und die murine mesenchymale Zell-Linie C3H10T1/2-BMP-2 als inducable osteoblastic progenitor cell angesehen werden. Die Zell-Linie hFOB 1.19 bietet aufgrund ihres humanen Ursprungs und der reproduzierbaren Expression osteogener Marker wie Alkalische Phosphatase, Prokollagen I und Osteocalcin die M{\"o}glichkeit, den humanen in vivo Osteogeneseprozess in vitro im Zellkultursystem zu imitieren. In der vorliegenden Studie gelingt es, im Rahmen der NSAR-Versuche die Schl{\"u}sselrolle des PGE2 sowohl im Knochenmetabolismus als auch bei der Entstehung heterotoper Ossifikationen, sowie dessen Mediatorfunktion in der Regulation osteoblastenspezifischer Differenzierungsparameter im Zellkulturmodell zu demonstrieren, obgleich der Nachweis der kalzifizierungsinhibierenden Wirkung Nichtsteroidaler Antiphlogistika, wie auch in der einschl{\"a}gigen Literatur, am Zellkultursystem weiterhin aussteht. Unter Ber{\"u}cksichtigung aller gewonnenen Daten kann in dieser Studie dokumentiert werden, dass die murine mesenchymale Progenitorzelle C3H10T1/2 unter BMP-2-Transfizierung und der Zugabe von Ascorbat und \&\#61538;-Glycerophosphat zu osteoblast{\"a}rer Differenzierung induziert wird, osteogene Eigenschaften entwickelt und im L{\"a}ngsschnitt der Studie deutliche Mineralisationstendenz aufweist.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gloeckner2001,
  author    = {Gl{\"o}ckner, Herma},
  title     = {Characterization of a new miniaturized hollow-fiber bioreactor for cultivation of cell lines and primary cells to improve cytostatic drug testing in vitro},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1181317},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Monolayer or suspension cell cultures are of only limited value as experimental models for human cancer. Therefore, more sophisticated, three-dimensional culture systems like spheroid cultures or histocultures are used, which more closely mimic the tumor in individual patients compared to monolayer or suspension cultures. As tissue culture or tissue engineering requires more sophisticated culture, specialized in vitro techniques may also improve experimental tumor models. In the present work, a new miniaturized hollow-fiber bioreactor system for mammalian cell culture in small volumes (up to 3 ml) is characterized with regard to transport characteristics and growth of leukemic cell lines (chapter 2). Cell and medium compartment are separated by dialysis membranes and oxygenation is accomplished using oxygenation membranes. Due to a transparent housing, cells can be observed by microscopy during culture. The leukemic cell lines CCRF-CEM, HL-60 and REH were cultivated up to densities of 3.5 x 107/ml without medium change or manipulation of the cells. Growth and viability of the cells in the bioreactor were the same or better, and the viable cell count was always higher compared to culture in Transwell{\^a} plates. As shown using CCRF-CEM cells, growth in the bioreactor was strongly influenced and could be controlled by the medium flow rate. As a consequence, consumption of glucose and generation of lactate varied with the flow rate. Influx of low molecular weight substances in the cell compartment could be regulated by variation of the concentration in the medium compartment. Thus, time dependent concentration profiles (e.g. pharmacokinetic profiles of drugs) can be realized as illustrated using glucose as a model compound. Depending on the molecular size cut-off of the membranes used, added growth factors like GM-CSF and IL-3 as well as factors secreted from the cells are retained in the cell compartment for up to one week. Second, a method for monitoring cell proliferation the hollow-fiber bioreactor by use of the Alamar BlueTM dye was developed (chapter 3). Alamar BlueTM is a non-fluorescent compound which yields a fluorescent product after reduction e.g. by living cells. In contrast to the MTT-assay, the Alamar BlueTM-assay does not lead to cell death. However, when not removed from the cells, the Alamar BlueTM dye shows a reversible, time- and concentration-dependent growth inhibition as observed for leukemic cell lines. When applied in the medium compartment of a hollow-fiber bioreactor system, the dye is delivered to the cells across the hollow-fiber membrane, reduced by the cells and released from the cell into the medium compartment back again. Thus, fluorescence intensity can be measured in medium samples reflecting growth of the cells in the cell compartment. This procedure offers several advantages. First, exposure of the cells to the dye can be reduced compared to conventional culture in plates. Second, handling steps are minimized since no sample of the cells needs to be taken for readout. Moreover, for the exchange of medium, a centrifugation step can be avoided and the cells can be cultivated further. Third, the method allows to discriminate between cell densities of 105, 106 and 107 of proliferating HL-60 cells cultivated in the cell compartment of the bioreactor. Measurement of fluorescence in the medium compartment is more sensitive compared to glucose or lactate measurement for cell counts below 106 cells/ml, in particular. In conclusion, the Alamar BlueTM-assay combined with the hollow-fiber bioreactor offers distinct advantages for the non-invasive monitoring of cell viability and proliferation in a closed system. In chapter 4 the use of the hollow-fiber bioreactor as a tool for toxicity testing was investigated, as current models for toxicity as well as efficacy testing of drugs in vitro allow only limited conclusions with regard to the in vivo situation. Examples of the drawbacks of current test systems are the lack of realistic in vitro tumor models and difficulties to model drug pharmacokinetics. The bioreactor proved to be pyrogen free and is steam-sterilizable. Leukemic cell lines like HL-60 and primary cells such as PHA-stimulated lymphocytes can be grown up to high densities of 1-3 x 107 and analyzed during growth in the bioreactor by light-microscopy. The cytostatic drug Ara-C shows a dose-dependent growth inhibition of HL-60 cells and a dose-response curve similar to controls in culture plates. The bioreactor system is highly flexible since several systems can be run in parallel, soluble drugs can be delivered continuously via a perfusion membrane and gaseous compounds via an oxygenation membrane which also allows to control pO2 and pH (via pCO2) during culture in the cell compartment. The modular concept of the bioreactor system allows realization of a variety of different design properties, which may lead to an improved in vitro system for toxicity testing by more closely resembling the in vivo situation. Whereas several distinct advantages of the new system have been demonstrated, more work has to be done to promote in vitro systems in toxicity testing and drug development further and to reduce the need for animal tests.},
  subject      = {Hohlfaserreaktor},
  language  = {en}
}