@phdthesis{Schmidt2012,
  author    = {Schmidt, Traudel},
  title     = {Establishment of Hey-triple-KO-ES cells and characterisation of Bre, a Hey binding partner},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85459},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Hey1, Hey2 and HeyL are downstream effectors of the Notch signalling pathway. Hey genes play decisive roles during embryonic development for example in cardiovascular development. However, the precise transcriptional programmes and genes, which are affected by each single Hey gene, are still poorly understood. One drawback for the analysis of Hey1, Hey2 or HeyL single gene function is that these genes are co-expressed in many tissues and share a high degree of functional redundancy. Thus, it was necessary to establish a system, which is either devoid of Hey expression, or just comprises one single Hey gene family member. For this, Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- as well as Hey-triple- knock out (KO)-ES cells (embryonic stem cells) were generated in this work, because ES cells and their differentiation as EBs (embryoid bodies) represent a valuable tool for the in vitro analysis of embryonic developmental processes. After the establishment of Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells, it could be seen by ALP staining and pluripotency marker expression that loss of Hey expression did not affect ES cell pluripotency features. Thus, these ES cells represent bona fide ES cells and could be further used for the differentiation as EBs. Here, differences in gene expression between Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells (after the loss of Hey1) could be observed in realtime-RT-PCR analysis for the endodermal marker AFP as well as for neural and myogenic markers in d10 EBs. However, the establishment of inducible Hey1, Hey2 or HeyL ES cell lines will be essential to confirm these findings and to search for novel Hey target genes. To get further insight into the mode of Hey action, the analysis of Hey interaction partners is necessary. One such binding partner, the Bre protein, has previously been found in a yeast-two-hybrid screen. Bre has been described to be a member of two distinct complexes (i.e. the nuclear BRCA1-A complex with a function in DNA damage response and the cytoplasmic BRISC complex), to directly interact with the TNF-receptor and Fas and to interfere with apoptotic signalling. The Hey-Bre interaction could be further corroborated in this work; yet, it was not possible to narrow down the interaction site of Bre with Hey1. It rather seems that non-overlapping parts of the Bre protein may bind to Hey. This interaction may be direct- pointing to more than one interaction site inside the Bre protein - or via a common binding partner such as the endogenous Bre protein itself. Besides the interaction studies, functional assays were performed for a more detailed characterisation of Hey1 and Bre interaction. Here, it could be shown that Hey1 over-expression did not have any influence on Bre sub-cellular localisation. Interestingly, it could be demonstrated that Bre positively interfered with Hey1 repressive function in luciferase assays at three of four promoters analysed. Moreover, interaction with Bre seems to lead to a stabilisation of Hey1. As Bre has been described to modulate the E3-ligase activity intrinsic to the BRCC complex it was analysed whether Bre over-expression results in an ubiquitination of Hey1. Yet, this could not be observed in the present work. Furthermore, an interaction of Bre with ubiquitinated proteins could not be demonstrated in an ubiquitin binding assay. To obtain a better insight into Bre function, Bre LacZ gene trap-ES cells and animals were generated. However, realtime-RT-analyses revealed that these cells and mice did not show a loss of Bre expression on mRNA level indicating that insertion mutagenesis did not occur as expected. However, embryos derived from these mice could nevertheless be used for the detection of tissues with Bre expression by β-galactosidase staining. Bre deficiency on mRNA levels was only achieved after the deletion of the floxed exon 3 resulting in the generation of Bre del-mice. Bre del-mice were fertile and without any obvious phenotype and they were used for the generation of Bre del- and wt-MEFs (murine embryonic fibroblasts). Characterisation of these cells showed that proliferation was not affected after loss of Bre (neither under normal nor under stress conditions). However, loss of Bre notably resulted in a reduction in the BRCA1 DNA damage response, in a slightly increased sensitivity towards apoptosis induction by FasL treatment and in an increase in the K63-poly-ubiquitin content in Bre del-cytoplasmic fractions, probably linked to a change in the BRISC de-ubiquitinase activity. Even though these results have the same tendencies as observed in former studies, the effects in the present work are less striking. Further studies as well as intercrossing of Bre del- to Hey KO-animals will be necessary to further understand the functional relevance of Hey and Bre interaction.},
  subject      = {Embryonale Stammzelle},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Zoeller2012,
  author    = {Zoeller, Maria Simone},
  title     = {Lipidperoxidation in der inkompatiblen Pseudomonas-Arabidopsis Interaktion: Biosynthese von Pimelin- und Azelains{\"a}ure},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71614},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die Biosynthese von fragmentierten Fetts{\"a}uren (kurzkettige Dicarbons{\"a}uren und deren Oxocarbons{\"a}ure-Vorstufen) ist in den meisten Pflanzen noch unklar. Wichtige, bekannte Dicarbons{\"a}uren sind Pimelins{\"a}ure (PIM) und Azelains{\"a}ure (AZA) mit den putativen Vorstufen 7-Oxo¬heptanons{\"a}ure (OHA) und 9-Oxononanons{\"a}ure (ONA). Es besteht großes Interesse die Biosynthese¬mechanismen und die Regulation der Synthese dieser Substanzen aufzukl{\"a}ren, da Fetts{\"a}ure¬fragmente an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. PIM ist eine essentielle Vorstufe von Biotin in Mikroben, Pilzen und Pflanzen. Bisher konnte die Biosynthese von PIM nur in Bakterien (E. coli und B. subtilis) aufgekl{\"a}rt werden. Es gibt keine Hinweise auf einen analogen Mechanismus in Pflanzen. Eine biologische Aktivit{\"a}t von AZA bei Pflanzen konnte erst vor kurzem beschrieben werden. Eine Forschergruppe identifizierte AZA als Metabolit, der nach Infektion mit dem Pathogen Pseudomonas syringae vermehrt im Phloemsaft von Arabidopsis vorhanden ist und der in Pflanzen eine lokale und systemische Resistenz gegen{\"u}ber dem Pathogen induziert. In Tieren sind Fetts{\"a}urefragmente ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung. Es ist bekannt, dass eine nichtenzymatische oxidative Fragmentierung von Fetts{\"a}urehydroperoxiden in komplexen Membranlipiden als Folge von oxidativem Stress abl{\"a}uft. Phospholipide mit veresterter ONA / AZA spielen aufgrund ihrer Struktur eine Rolle als endogene Liganden bei Reaktionen des angeborenen Immunsystems. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen der Oxidation von Fetts{\"a}uren und deren Fragmentierung in Pflanzen aufzukl{\"a}ren. Weiterhin sollte die Rolle der oxidierten Fragmente in der Immunantwort der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht werden. In Pflanzen wurden fragmentierte Fetts{\"a}uren im Rahmen dieser Arbeit erstmals in komplexen Lipiden identifiziert und verschiedene Hypothesen zur Bildung von Fetts{\"a}urefragmenten experimentell {\"u}berpr{\"u}ft. Es konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese der Fetts{\"a}urefragmente in A. thaliana ausgehend von zwei- oder dreifach unges{\"a}ttigten Fetts{\"a}uren stattfindet. 9- und 13-Lipoxygenasen (LOX1, LOX5 und LOX2) spielen dabei keine essentielle Rolle. Die Fetts{\"a}urefragmente konnten in Arabidopsis in freier Form und in komplexen Lipiden verestert (ausschließlich in Galactolipiden) detektiert werden. Applikationsexperimente zeigten, dass die Biosynthese der Fetts{\"a}urefragmente in den komplexen Lipiden auf nichtenzymatischem Wege in situ stattfindet. Dabei wird in {\"U}bereinstimmung mit den experimentellen in vitro und in vivo Daten als Reaktionsmechanismus die Dimer-Hypothese der Arbeitsgruppe um Alan Brash vorgeschlagen. In gr{\"u}nen Pflanzenteilen verl{\"a}uft die Biosynthese demzufolge in drei Schritten ab: Im ersten Schritt entsteht ein „Pool" von oxidierten Galactolipiden mit Hydroperoxid-Acylketten (mit konjugierten Dienen). Diese Hydroperoxide entstehen fortlaufend durch Oxidation der Fetts{\"a}ureacyle mittels Singulett Sauerstoff in Plastiden. Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae (avirulenter Stamm) wird der „Pool" von Galactolipidperoxiden durch die katalytische Einwirkung von freien Radikalen und der LOX2 erh{\"o}ht. Im zweiten Schritt findet eine Radikal-katalysierte Addition von Peroxylradikalen an Fetts{\"a}urehydroperoxide statt, wobei Lipid-Peroxid-Dimere gebildet werden. Diese instabilen Zwischenprodukte zerfallen spontan in vier Produkte, darunter zwei Aldehyd-Fragmente, ein Alkoxyradikal und ein Hydroxylradikal. Bemerkenswert ist, dass durch die Fragmentierung des Dimers weitere Radikale de novo entstehen. Im dritten Schritt k{\"o}nnen die in Galactolipiden veresterten Oxocarbons{\"a}uren zu Dicarbons{\"a}uren oxidiert werden. Hydroperoxide, die Vorl{\"a}ufer der Fetts{\"a}urefragmente, wurden in freier Form und in komplexen Lipiden verestert analysiert. Unter basalen Bedingungen liegt sowohl bei den freien, als auch bei den veresterten Hydroxyfetts{\"a}uren ein fast komplett Singulett Sauerstoff abh{\"a}ngiger Oxidationsmechanismus vor. Drei Galactolipid Hauptspezies (Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)-18:3-16:3, Digalactosyldiacylglycerol (DGDG)-18:3-18:3 und DGDG-18:3-16:3) sind hoch oxidiert (5 bis 9 Mol-\%, relativ zur jeweiligen Vorstufe). MGDG-18:3-18:3, ebenso wie Phosphatidylglycerol-, Phosphatidylinositol- und Triacylglycerol-Hydroxyfetts{\"a}urespezies liegen basal nur schwach oxidiert vor (< 2 Mol-\%). Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae kommt es zu einer massiven Lipid Biosynthese und Oxidation durch die 13-Lipoxygenase LOX2, Singulett Sauerstoff und freie Radikale. Der Oxidationsgrad der Hydroxyfetts{\"a}uren in den Galactolipiden {\"a}ndert sich kaum. Innerhalb der Triacylglycerole kommt es zu einem großen Anstieg der oxidierten Spezies (auf 12 bis 38 Mol-\%). Die Oxidation und Fragmentierung der Fetts{\"a}uren in den Galactolipiden unter basalen Bedingungen und induziert durch die Pathogenbehandlung, stellen einen wichtigen biochemischen Prozess dar, auf dem PIM und AZA entstehen.},
  subject      = {Schmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pinkert2008,
  author    = {Pinkert, Stefan},
  title     = {The human proteome is shaped by evolution and interactions},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35566},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Das menschliche Genom ist seit 2001 komplett sequenziert. Ein Großteil der Proteine wurde mittlerweile beschrieben und t{\"a}glich werden bioinformatische Vorhersagen praktisch best{\"a}tigt. Als weiteres Großprojekt wurde k{\"u}rzlich die Sequenzierung des Genoms von 1000 Menschen gestartet. Trotzdem ist immer noch wenig {\"u}ber die Evolution des gesamten menschlichen Proteoms bekannt. Proteindom{\"a}nen und ihre Kombinationen sind teilweise sehr detailliert erforscht, aber es wurden noch nicht alle Dom{\"a}nenarchitekturen des Menschen in ihrer Gesamtheit miteinander verglichen. Der verwendete große hochqualitative Datensatz von Protein-Protein-Interaktionen und Komplexen stammt aus dem Jahr 2006 und erm{\"o}glicht es erstmals das menschliche Proteom mit einer vorher nicht m{\"o}glichen Genauigkeit analysieren zu k{\"o}nnen. Hochentwickelte Cluster Algorithmen und die Verf{\"u}gbarkeit von großer Rechenkapazit{\"a}t bef{\"a}higen uns neue Information {\"u}ber Proteinnetzwerke ohne weitere Laborarbeit zu gewinnen. Die vorliegende Arbeit analysiert das menschliche Proteom auf drei verschiedenen Ebenen. Zuerst wurde der Ursprung von Proteinen basierend auf ihrer Dom{\"a}nenarchitektur analysiert, danach wurden Protein-Protein-Interaktionen untersucht und schließlich erfolgte Einteilung der Proteine nach ihren vorhandenen und fehlenden Interaktionen. Die meisten bekannten Proteine enthalten mindestens eine Dom{\"a}ne und die Proteinfunktion ergibt sich aus der Summe der Funktionen der einzelnen enthaltenen Dom{\"a}nen. Proteine, die auf der gleichen Dom{\"a}nenarchitektur basieren, das heißt die die gleichen Dom{\"a}nen in derselben Reihenfolge besitzen, sind homolog und daher aus einem gemeinsamen urspr{\"u}nglichen Protein entstanden. Die Dom{\"a}nenarchitekturen der urspr{\"u}nglichen Proteine wurden f{\"u}r 750000 Proteine aus 1313 Spezies bestimmt. Die Gruppierung von Spezies und ihrer Proteine ergibt sich aus taxonomischen Daten von NCBI-Taxonomy, welche mit zus{\"a}tzlichen Informationen basierend auf molekularen Markern erg{\"a}nzt wurden. Der resultierende Datensatz, bestehend aus 5817 Dom{\"a}nen und 32868 Dom{\"a}nenarchitekturen, war die Grundlage f{\"u}r die Bestimmung des Ursprungs der Proteine aufgrund ihrer Dom{\"a}nenarchitekturen. Es wurde festgestellt, dass nur ein kleiner Teil der neu evolvierten Dom{\"a}nenarchitekturen eines Taxons gleichzeitig auch im selben Taxon neu entstandene Proteindom{\"a}nen enth{\"a}lt. Ein weiteres Ergebnis war, dass Dom{\"a}nenarchitekturen im Verlauf der Evolution l{\"a}nger und komplexer werden, und dass so verschiedene Organismen wie der Fadenwurm, die Fruchtfliege und der Mensch die gleiche Menge an unterschiedlichen Proteinen haben, aber deutliche Unterschiede in der Anzahl ihrer Dom{\"a}nenarchitekturen aufweisen. Der zweite Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Frage wie neu entstandene Proteine Bindungen mit dem schon bestehenden Proteinnetzwerk eingehen. In fr{\"u}heren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Protein-Interaktions-Netzwerk ein skalenfreies Netz ist. Skalenfreie Netze, wie zum Beispiel das Internet, bestehen aus wenigen Knoten mit vielen Interaktionen, genannt Hubs, und andererseits aus vielen Knoten mit wenigen Interaktionen. Man vermutet, dass zwei Mechanismen zur Entstehung solcher Netzwerke f{\"u}hren. Erstens m{\"u}ssen neue Proteine um auch Teil des Proteinnetzwerkes zu werden mit Proteinen interagieren, die bereits Teil des Netzwerkes sind. Zweitens interagieren die neuen Proteine, gem{\"a}ß der Theorie der bevorzugten Bindung, mit h{\"o}herer Wahrscheinlichkeit mit solchen Proteinen im Netzwerk, die schon an zahlreichen weiteren Protein-Interaktionen beteiligt sind. Die Human Protein Reference Database stellt ein auf Informationen aus in-vivo Experimenten beruhendes Proteinnetzwerk f{\"u}r menschliche Proteine zur Verf{\"u}gung. Basierend auf den in Kapitel I gewonnenen Informationen wurden die Proteine mit dem Ursprungstaxon ihrer Dom{\"a}nenarchitekturen versehen. Dadurch wurde gezeigt, dass ein Protein h{\"a}ufiger mit Proteinen, die im selben Taxon entstanden sind, interagiert, als mit Proteinen, die in anderen Taxa neu aufgetreten sind. Es stellte sich heraus, dass diese Interaktionsraten f{\"u}r alle Taxa deutlich h{\"o}her waren, als durch das Zufallsmodel vorhergesagt wurden. Alle Taxa enthalten den gleichen Anteil an Proteinen mit vielen Interaktionen. Diese zwei Ergebnisse sprechen dagegen, dass die bevorzugte Bindung der alleinige Mechanismus ist, der zum heutigen Aufbau des menschlichen Proteininteraktion-Netzwerks beigetragen hat. Im dritten Teil wurden Proteine basierend auf dem Vorhandensein und der Abwesenheit von Interaktionen in Gruppen eingeteilt. Proteinnetzwerke k{\"o}nnen in kleine hoch vernetzte Teile zerlegt werden, die eine spezifische Funktion aus{\"u}ben. Diese Gruppen k{\"o}nnen mit hoher statistischer Signifikanz berechnet werden, haben meistens jedoch keine biologische Relevanz. Mit einem neuen Algorithmus, welcher zus{\"a}tzlich zu Interaktionen auch Nicht-Interaktionen ber{\"u}cksichtigt, wurde ein Datensatz bestehend aus 8,756 Proteinen und 32,331 Interaktionen neu unterteilt. Eine Einteilung in elf Gruppen zeigte hohe auf Gene Ontology basierte Werte und die Gruppen konnten signifikant einzelnen Zellteilen zugeordnet werden. Eine Gruppe besteht aus Proteinen, welche wenige Interaktionen miteinander aber viele Interaktionen zu zwei benachbarten Gruppen besitzen. Diese Gruppe enth{\"a}lt eine signifikant erh{\"o}hte Anzahl an Transportproteinen und die zwei benachbarten Gruppen haben eine erh{\"o}hte Anzahl an einerseits extrazellul{\"a}ren und andererseits im Zytoplasma und an der Membran lokalisierten Proteinen. Der Algorithmus hat damit unter Beweis gestellt das die Ergebnisse nicht bloß statistisch sondern auch biologisch relevant sind. Wenn wir auch noch weit vom Verst{\"a}ndnis des Ursprungs der Spezies entfernt sind, so hat diese Arbeit doch einen Beitrag zum besseren Verst{\"a}ndnis der Evolution auf dem Level der Proteine geleistet. Im Speziellen wurden neue Erkenntnisse {\"u}ber die Beziehung von Proteindom{\"a}nen und Dom{\"a}nenarchitekturen, sowie ihre Pr{\"a}ferenzen f{\"u}r Interaktionspartner im Interaktionsnetzwerk gewonnen.},
  subject      = {Evolution},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Cordes2007,
  author    = {Cordes, Tatjana},
  title     = {Bindungsverhalten der verschiedenen NFAT-Transkriptionsfaktoren an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsf{\"a}higkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77-Promotors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25964},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Sowohl NFAT- (Nukle{\"a}re Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- ('myosin-enhancer factor 2') Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und k{\"o}nnen dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Ver{\"o}ffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsf{\"a}higkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterst{\"u}tzt, ist jedoch nicht wesentlich beeintr{\"a}chtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden k{\"o}nnen. Dagegen f{\"u}hrt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden k{\"o}nnen. In ihrer F{\"a}higkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/\&\#945;A, NFATc1/\&\#945;C oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine m{\"o}gliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist.},
  subject      = {Transkriptionsfaktor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Weber2004,
  author    = {Weber, Florian},
  title     = {Screening der apoptoseinduzierenden Interaktionen von Nephrotoxinen unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung von Ochratoxin A},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9821},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80\% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt haupts{\"a}chlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im t{\"a}glichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl m{\"o}glicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivit{\"a}t und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten anges{\"a}t wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung best{\"a}tigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von hom{\"o}ostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abh{\"a}ngig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. f{\"u}r H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, w{\"a}hrend NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten {\"u}berwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabh{\"a}nigig.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stuermer2004,
  author    = {St{\"u}rmer, Andrea},
  title     = {Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex" (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des pr{\"a}replikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgel{\"o}st wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich f{\"u}r die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivit{\"a}t der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin f{\"u}r den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den pr{\"a}replikativen Komplex vervollst{\"a}ndigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzukl{\"a}ren. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellul{\"a}ren Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-F{\"a}rbung mit Antik{\"o}rpern gegen eine konservierte Dom{\"a}ne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antik{\"o}rpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch f{\"u}r die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte {\"u}ber Immunpr{\"a}zipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin pr{\"a}zipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine w{\"a}hrend der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down" des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System erm{\"o}glicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte St{\"o}rung des Zellwachstums hin. Zus{\"a}tzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollst{\"a}ndig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen m{\"o}glichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auff{\"a}llig h{\"a}ufig lagen in MCM3-„knock-down"-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Ph{\"a}notypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukle{\"a}rer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down"-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des pr{\"a}replikativen Komplexes eine zus{\"a}tzliche Funktion in der Mitose aus{\"u}ben.},
  subject      = {Replikation},
  language  = {de}
}