@phdthesis{Rauchfuss2008,
  author    = {Rauchfuß, Steffen},
  title     = {Der Einfluss des Insulins auf die Thrombozyten und auf die Wechselwirkung zwischen den Blutpl{\"a}ttchen und dem Endothel},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28432},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Unter physiologischen Bedingungen spielen die Thrombozyten oder Blutpl{\"a}ttchen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der H{\"a}mostase. Indem sie in Blutgef{\"a}ßen besch{\"a}digte Bereiche erkennen und sich dort gezielt anheften k{\"o}nnen, verhindern sie das Austreten von Blut in subendotheliale Bereiche und halten eine Blutung gering. Intrazellul{\"a}re Signalmolek{\"u}le kontrollieren das Zusammenspiel der Pl{\"a}ttchenagonisten und der dazugeh{\"o}rigen Rezeptoren und regulieren somit die Aktivierung der Blutpl{\"a}ttchen. Verschiedene vorangegangene Publikationen demonstrierten sowohl aktivierende als auch inhibierende Effekte des Insulins auf die Aktivierung, Adh{\"a}sion und Aggregation der Blutpl{\"a}ttchen. Diese durch das Insulin hervorgerufenen Effekte sollen haupts{\"a}chlich {\"u}ber den cGMP und cAMP Signalweg sowie {\"u}ber die Aktivierung von eNOS durch Insulin in den Blutpl{\"a}ttchen wirken. Unsere Forschungsergebnisse weisen darauf hin, daß ein akuter, durch das Insulin hervorgerufener Effekt auf die Blutpl{\"a}ttchen sowohl unter physiologischen wie auch unter pathologischen Glukosekonzentrationen nicht nachweisbar ist. Insulin zeigte keine Wirkung auf die intrazellul{\"a}ren Signalmolek{\"u}le PKB, VASP, P38 und ERK, welche in der Aktivierung/Hemmung der Blutpl{\"a}ttchen eine wichtige Rolle spielen. Gleichfalls blieb eine Wirkung auf die Aggregation der Blutpl{\"a}ttchen und Aktivierung des Oberfl{\"a}chenrezeptors Integrin \&\#945;IIb\&\#946;3 sowie die Expression von P-Selektin auf der Oberfl{\"a}che der Thrombozyten nach der Stimulation durch Insulin aus. Auch konnte der Insulinrezeptor durch uns auf der Oberfl{\"a}che der Thrombozyten weder in seiner unphosphorylierten, noch in seiner phosphorylierten Form nach der Stimulation mit Insulin nachgewiesen werden. Zusammen mit dem Fehlen eines direkten, akuten Insulin-abh{\"a}ngigen Effekts auf die Thrombozyten l{\"a}ßt dies auf das Fehlen eines funktionell aktiven Insulinrezeptors auf der Oberfl{\"a}che der Thrombozyten schließen. Wir konnten zeigen, daß eNOS in den Blutpl{\"a}ttchen nicht vorhanden und damit seine in anderen Publikationen beschriebene Aktivierung durch Insulin in den Thrombozyten nicht gegeben ist. Der von uns und in anderen Publikationen verwendete Antik{\"o}rper gegen phospho-eNOS erkennt vielmehr ein anderes Protein gleicher Gr{\"o}ße, wie wir im Kontrollexperiment mit eNOS-/- knockout M{\"a}usen zeigen konnten. Im Flußkammerexperiment konnte ein indirekter insulinabh{\"a}ngiger Effekt auf die Adh{\"a}sion der Thrombozyten an das Endothel und ihre Bildung von Aggregaten beobachtet werden. Die Gabe von pathologischen Insulinmengen f{\"u}hrte zu einem Anstieg der NO Sekretion durch das Endothel, welches hemmend auf die Adh{\"a}sion und Aggregation der Thrombozyten wirkte.},
  subject      = {Thrombozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Vielreicher2008,
  author    = {Vielreicher, Martin Christian},
  title     = {Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung der Inaktivierung der Tyrosinkinase SRC im Integrin alphaIIb-beta3 -Signalweg},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26743},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Essentiell f{\"u}r die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage f{\"u}r zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies {\"u}bernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-R{\"u}ckzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterf{\"u}hrende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle f{\"u}r die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System f{\"u}r Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden.},
  subject      = {Antigen CD41},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Thumati2008,
  author    = {Thumati, Naresh Reddy},
  title     = {Characterization of new protein kinases of the EVH1 domain containing protein VASP and identification of binding partners for a new EVH1 domain of the Spred2 protein : A case study on protein interactions of EVH1 domain containing proteins},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26617},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Protein interactions as mediated by catalytic or non-catalytic protein domains contribute to cellular signal transduction processes by covalent protein modification of or non-covalent binding to interaction partners. Ena/VASP homology 1 (EVH1) domains are found in different signal transduction proteins as N-terminal non-catalytic adaptor modules of ~ 115 amino acids sharing a common fold. By targeting their host proteins to subcellular sites of action they are involved in several signalling cascades which include protein phosphorylation and cytoskeletal reorganisation. In this study, protein interactions of the two EVH1 domain containing proteins VASP and Spred2 were studied according to their involvement in different and non-overlapping signal transduction pathways of the cell. EVH1 domains were first described in the Ena/VASP protein family with the Vasodilator-stimulated phosphoprotein VASP being its founding member. As a cytoskeleton-associated protein VASP not only interacts with different proteins of the actin network but it is also a substrate for cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. However the full complement of protein kinases targeting VASP as their substrate is still unknown. Here we used mouse cardiac fibroblast (MCFB) cells in order to study the phosphorylation status of VASP and identify new candidate protein kinases involved after serum stimulation of these cells. Using phosphosite-specific antibodies we found that serum stimulation induces a phosphorylation of VASP at Ser-157 in a time-dependent manner reaching its maximum after 90 min of stimulation. We developed an interaction graph model of possible candidate protein kinases involved. Using a pharmacological perturbation analysis with different combinations of specific protein kinase inhibitors and activators we excluded any contribution of cGMP-dependent protein kinase and Rho kinases to this process and identified a combined action of classical isoforms of PKCs and PKA in serum-stimulated VASP phosphorylation at Ser-157 positioning PKC upstream of PKA in this signalling pathway. We hypothesise that PKC receives an external stimulatory signal upon serum stimulation of MCFB cells which is passed either directly or indirectly to PKA which finally phosphorylates VASP at Ser-157. A new EVH1 domain has been described recently in the Spred proteins (Sprouty related proteins containing an EVH1 domain) which are inhibitors of the Ras/Raf/MAP kinase pathway. Our laboratory has been involved in the elucidation of the atomic structure of the human Spred2 EVH1 domain by protein NMR spectroscopy (PDB 2JP2; 2007). A positively charged binding interface of this EVH1 domain suggests an interaction with negatively charged ligands; however no interaction partners of this domain have been described so far. In the second part of this study, we used different genetic and biochemical screening methods to search for ligands of the Spred2 EVH1 domain. A bacterial two-hybrid system was established using a physically well characterized interaction of the VASP EVH1 domain with a panel of its ActA binding peptides as positive controls to screen a human brain cDNA expression library at different stringencies for candidate Spred2 EVH1 interaction partners. However none of the clones isolated could be genetically and physically validated to support Spred2 EVH1 specific interactions. An in-vitro screening of a 9-mer phage display peptide library using purified GST-Spred2 EVH1 fusion protein was performed together with a Fyn-SH3 fusion protein as a positive control. In contrast to the Fyn-SH3 domain the majority of phages isolated with the Spred2 EVH1 domain either carried no inserts or inserts with stop codons suggesting a highly non-specific interaction of the phage coat protein with the latter domain but neither the Fyn-SH3 domain nor the GST moiety. Isolation of a 13-mer proline-rich sequence was particularly surprising in this context. In order to address possible interactions of the Spred2 EVH1 domain with non-peptidergic ligands protein-lipid interaction assays were performed. Quantitative binding studies to purified Spred2 EVH1 using a liposome sedimentation assay however excluded any interaction of candidate phospholipids of the phosphatidyl inositol phosphate class with the Spred2 EVH1 domain. A natively folded and thus binding-competent conformation of the purified proteins used was assessed independently by 1H protein NMR spectroscopy. In summary the cumulative evidence of our genetic and biochemical screening experiments suggests that the still elusive Spred2 EVH1 ligand(s) may be formed of hydrophobic peptide epitopes larger than nine amino acids in size and carrying negative charge(s). A phosphorylation of Spred2 EVH1 binding epitopes by a post-translational modification should be seriously considered in future experiments.},
  subject      = {VASP},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Wagner2007,
  author    = {Wagner, Toni},
  title     = {Activity and Crosstalk of STAT3 and BMP Signalling Pathways in Pluripotency Control of Mouse and Medaka Stem Cells},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26495},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {- 77/83 allerdings inaktiv in Kulturen und Embryonen von Medaka. Dieser Unterschied wird durch Daten aus humanen ES-Zellkulturen unterst{\"u}tzt. Letztere sind ebenfalls komplett STAT3 unabh{\"a}ngig. Die BMP-Smad Kaskade wiederum ist in Medaka-Stammzellen aktiv, Antidifferenzierungsgene wie id2, die durch BMP direkt kontrolliert werden, sind dementsprechend exprimiert. Diese Daten stimmen wiederum mit dem Maussystem {\"u}berein, w{\"a}hrend humane ES-Zellen diesbez{\"u}glich bislang nicht untersucht wurden. Die Interaktion zwischen verschiedenen Signalwegen ist ein bisher noch nicht gut verstandenes Gebiet. Die Integration verschiedener Signale ist aber speziell f{\"u}r Stammzellen, die ihr Differenzierungsschicksal von winzigen Abweichungen in der Signalmixtur abh{\"a}ngig machen, von entscheidender Bedeutung. Im zweiten Teil der hier vorgelegten Arbeit konnte eine Interaktion zwischen dem BMP-Rezeptor 1a und STAT3 nachgewiesen werden. Diese Interaktion ist offenbar Teil eines variablen Komplexes. Zum ersten Mal war es auch m{\"o}glich, funktionale Konsequenzen f{\"u}r STAT3 nach Stimulierung des BMP-Rezeptors 1a zu dokumentieren. Nach Belegung des BMP-Rezeptors 1a mit dem mutierten BMP2-A34D wird STAT3 trotz Aktivierung durch Phosphorylierung an Tyrosin 705 im Zytoplasma von Maus Stammzellen festgehalten. Zusammengenommen konnte hier gezeigt werden, dass eine Interaktion zwischen den bislang als isoliert betrachteten Signalwegen BMP-Smad und STAT3 besteht. Des Weiteren wurde das Medaka-Stammzellkultursystem benutzt, um zu zeigen, dass STAT3 f{\"u}r die Pluripotenz von Stammzellen nur im Maussystem eine Rolle spielt, wohingegen BMPZielgene wie id2 in bislang allen getesteten ES-Zellkultursystemen aktiv sind.},
  subject      = {Stammzellen},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Teichmann2007,
  author    = {Teichmann, Lino Lars},
  title     = {Stromabw{\"a}rts der cGMP-abh{\"a}ngigen Proteinkinase in Thrombozyten - Physiologische und diagnostische Relevanz von VASP und Identifikation neuer Substrate},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25843},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskul{\"a}rer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein betr{\"a}chtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein ad{\"a}quates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zus{\"a}tzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Pl{\"a}ttchen-Inhibition deutlich wider. Demgegen{\"u}ber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator f{\"u}r den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abh{\"a}ngigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicyls{\"a}ure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozyt{\"a}ren Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Pl{\"a}ttchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abh{\"a}ngigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Pl{\"a}ttchenadh{\"a}sion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erh{\"o}hen die intrazellul{\"a}re Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies f{\"u}hrt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, haupts{\"a}chlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abh{\"a}ngige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schl{\"u}ssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Pl{\"a}ttcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zun{\"a}chst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Pl{\"a}ttchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht best{\"a}tigen. Weitere Anstrengungen werden n{\"o}tig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten M{\"a}usen im Vergleich zu Wildtyp-M{\"a}usen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Pl{\"a}ttchen gest{\"o}rt ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antik{\"o}rper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen St{\"o}rungen von Thrombozytenfunktionen f{\"u}hrt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden.},
  subject      = {Blutstillung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Renne2007,
  author    = {Renn{\´e}, Thomas},
  title     = {Strukturelle und funktionelle Analyse der Interaktion des Blutgerinnungsfaktors XI mit H-Kininogen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25463},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Im Blutplasma und auf Zelloberfl{\"a}chen bildet H-Kininogen entweder mit dem Blutgerinnungsfaktor XI oder Plasmakallikrein Komplexe. Die beiden Proteasenvorstufen binden {\"u}ber ihre homologen schweren Ketten, die jeweils aus vier Apple Dom{\"a}nen bestehen (F1-F4 bei Faktor XI und P1-P4 bei Kalllikrein), an HK. Die Kalllikrein/Kininogen Interaktion wird {\"u}ber Dom{\"a}ne P2 vermittelt. Im Gegensatz dazu soll FXI {\"u}ber F1 an Kininogen binden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Lokalisation der Kininogen-Bindungsstelle des Faktors XI und ein funktioneller Vergleich der Kalllikrein/Kininogen und Faktor XI/Kininogen Komplexe. Es zeigt sich, dass die relative Bindungsaffinit{\"a}t von HK an rekombinante Faktor XI-Einzeldom{\"a}nen in der Reihenfolge F2 >> F4 > F1 >> F3 abf{\"a}llt. Die Bedeutung der F2 Dom{\"a}ne f{\"u}r die Kininogen Bindung wird durch den monoklonale Antik{\"o}rper \&\#945;P2 unterstrichen, der die Faktor XI/Kininogen und die Kalllikrein/Kininogen Bindung mit einem apparenten IC50 von 8 nM blockiert und dessen Epitop auf die F2 Dom{\"a}ne kartiert wird. Eine Thrombozyten-spezifische Faktor XI-Splicevariante, der die N-terminale H{\"a}lfte der F2 Dom{\"a}ne fehlt, bindet 5-fach schlechter als Faktor XI an Kininogen. Nach Aktivierung wird Kallikrein und ein chim{\"a}res Faktor XI-Protein, bei dem F2 durch P2 ersetzt wurde, in P2 gespalten, was zur Verlust der Bindungsaffinit{\"a}t zu Kininogen f{\"u}hrt. Im Gegensatz bleibt die Bindung von aktiviertem Faktor XI oder einem chim{\"a}rem Kalllikrein-Protein, bei dem die P2 Dom{\"a}ne durch F2 ersetzt wurde, nach Aktivierung an Kininogen gebunden. Diese Daten zeigen, dass Faktor XI und Kallikrein {\"u}ber ihre Dom{\"a}nen 2 an Kininogen binden. Trotz homologer Bindungsmotive unterscheiden sich Faktor XI/Kininogen und Kallikrein/Kininogen Komplexe in ihrer Stabilit{\"a}t nach Aktivierung. Die Daten tragen dazu bei, die Regulation der Kallikrein-vermittelten Bradykininbildung bei Entz{\"u}ndungsprozessen und die Faktor XI-getriebene Fibrinbildung besser zu verstehen.},
  subject      = {Gerinnungsfaktor XI},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Benz2007,
  author    = {Benz, Peter Michael},
  title     = {Cytoskeleton assembly at endothelial cell-cell contacts is regulated by Alpha-II-spectrin/vasp complexes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23802},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Directed cortical actin assembly is the driving force for intercellular adhesion. Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) participates in actin-fiber formation and VASP activity is regulated by phosphorylations. We screened for endothelial cell proteins, which bind to VASP dependent on its phosphorylation status. Differential proteomics identified \&\#945;II-spectrin as novel VASP-interacting protein. \&\#945;II-spectrin binds to the triple GP5-motif in VASP via its SH3 domain. cAMP-dependent protein kinase-mediated VASP phosphorylation at Ser157 inhibits \&\#945;II-spectrin/VASP complex formation. VASP becomes dephosphorylated upon formation of cell-cell contacts and in confluent but not in sparse endothelial cells \&\#945;II-spectrin colocalizes with non-phosphorylated VASP at cell-cell junctions. Ectopic expression of the \&\#945;II-spectrin SH3 domain fused to claudin-5 translocates VASP to cell-cell contacts and is sufficient to initiate the formation of cortical actin cytoskeletons. \&\#945;II-spectrin SH3 domain overexpression stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, permeability of VASP-deficient endothelial cells is elevated. In a skin edema model, microvascular leakage is increased in VASP-deficient over wild-type mice. We propose that \&\#945;II-spectrin/VASP complexes regulate cortical actin cytoskeleton assembly with implications for formation of endothelial cell-cell contacts and regulation of vascular permeability.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kuehler2007,
  author    = {K{\"u}hler, Leif Heinrich},
  title     = {Identifizierung Genetischer Defekte der Famili{\"a}ren Dilatativen Kardiomyopathie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22845},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Herzinsuffizienz ist eine Krankheit mit wachsender medizinischer und {\"o}konomischer Bedeutung. Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine der Hauptursachen f{\"u}r Herzversagen und f{\"u}hrt in den meisten F{\"a}llen zu einer Herztransplantation. 20-30 \% der DCM-Erkrankungen haben einen genetischen Hintergrund. Durch die Anwendung molekulargenetischer Methoden konnte bereits eine Reihe DCM-verursachender Gene identifiziert werden. Mutationen in Zytoskelettproteinen f{\"u}hrten zu der Hypothese, dass eine Beeintr{\"a}chtigung der Kraft{\"u}bertragung vom Sarkomer auf be-nachbarte Myozyten eine Ursache f{\"u}r die DCM sein k{\"o}nnte. Zus{\"a}tzlich scheint auch eine reduzierte Kraftentwicklung, ausgel{\"o}st durch Mutationen in den Proteinen des Sarkomers die Entwicklung der DCM zu beg{\"u}nstigen. Dar{\"u}ber hinaus wurden Mutationen in Proteinen gefunden, wie z.B. im Lamin A/C- oder Tafazzin-Gen, deren Rolle in der Pathophysiologie der DCM noch nicht gekl{\"a}rt sind. Um die Komplexit{\"a}t der genetischen Defekte, die eine DCM verursachen, besser zu verste-hen, ist es notwendig weitere krankheitsverursachende Gene zu identifizieren. Im ersten Projekt untersuchten wir eine Familie (DCM-I) mit 16 an DCM erkrankten Familienmit-gliedern. Der Ph{\"a}notyp folgte einem autosomal-dominanten Erbgang. Nach Ausschluss aller be-kannter DCM-Loci, f{\"u}hrten wir eine genomweite genetische Suche mit den Mikrosatellitenmarkern der 10. Version des Weber-Screeningsets durch. Durch die Kopplungsanalyse war es m{\"o}glich, ge-netische Kopplung f{\"u}r 80 \% des Genoms auszuschließen. Mehrere benachbarte Marker auf dem langen Arm von Chromosom 7 zeigten hingegen Kosegregation mit dem Krankheitsstatus. Ein maximaler LOD-Score von 4,20 wurde f{\"u}r die Marker D7S471 und D7S501 erzielt. Die Feinkartie-rung mit zus{\"a}tzlichen Markern identifizierte eine Kandidatenregion, die von den beiden Markern D7S2545 und D7S2554 begrenzt wird und ein Intervall von 9,73 Mb umschließt. In dem minima-len Intervall sind 32 Gene sowie 6 aufgrund von Sequenzvergleichen vorhergesagte Transkripte kodiert. Keines dieser Gene kodiert f{\"u}r ein Zytoskelett- oder Sarkomerprotein. Durch Sequenzana-lyse konnten wir eine neue DCM-verursachende Mutation (A100G) in Exon 2 des Gens DLD iden-tifizieren, das f{\"u}r das mitochondriale Protein Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) kodiert. Die Mutation ver{\"a}nderte die vorletzte Aminos{\"a}ure des Signalpeptids, das den Import des Proteins in die Mitochondrien dirigiert. Daher hatten wir die Hypothese, dass m{\"o}glichweise der Transport oder die Prozessierung des Signalpeptids beeintr{\"a}chtigt sein k{\"o}nnte. Dazu haben wir das DLD-Signalpeptid mit GFP markiert und die Verteilung des Fusionsproteins in transfizierten humanen Zellen und in isolierten Mitochondrien untersucht. Die Resultate zeigten, dass die Fusionsproteine mit dem mu-tierten Signalpeptid genauso in die Mitochondrien transportiert und prozessiert wurden, wie die Fusionsproteine mit dem Wildtyp-Signalpeptid. Die Enzymaktivit{\"a}t der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase in Lymphozyten mit der Mutation A100G liegt innerhalb der normalen Brandbreite und ist im Vergleich zu der Enzymaktivit{\"a}t in Kontroll-Lymphozyten nicht reduziert. Die Identifikation von DLD, einem Protein des Energiemetabolismus, als neues DCM-verursachendes Gen in Familie DCM-I, kann zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der komplexen Pa-thophysiologie der dilatativen Kardiomyopathie beitragen. Im zweiten Projekt haben wir eine Familie (DCM-II) untersucht, in der die erkrankten Familien-mitglieder eines oder meherer der folgende Symptome aufwiesen: Reizleitungsst{\"o}rungen, Schlag-anfall, dilatative Kardiomyopathie, Gliederg{\"u}rtel-Muskeldystrophie. Dilatative Kardiomyopathie assoziiert mit Reizleitungsst{\"o}rungen und Skelettmyopathie ist mit Mutationen im Gen f{\"u}r Lamin A und Lamin C (LMNA) korreliert. Zus{\"a}tzlich wurden Mutationen im LMNA in Zusammenhang mit der Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie, der Gliederg{\"u}rtel-Muskeldystrophie, Lipodystrophie, dem Charcot-Marie-Tooth-Syndrom und der Hutchinson-Gilford Progerie beschrieben. Da {\"u}ber 90 \% der LMNA-Mutationen Missense-Mutationen sind, resultierte daraus die Hypothese, dass die mu-tierten Proteine {\"u}ber einen dominant-negativen Effekt die dreidimensionale Struktur der Lamin-Intermedi{\"a}rfilamente zerst{\"o}ren. Durch Sequenzanalyse der proteinkodierenden Exons des LMNA konnten wir einen Basenpaaraus-tausch von C nach T an Position 700 (C700T) in Exon 4 identifizieren, der mit dem Ph{\"a}notyp in der Familie segregierte. Die Mutation f{\"u}hrte zum Einbau eines vorzeitigen Stop-Codons (PTC) an Position 234 (Q234X) der Aminos{\"a}uresequenz. Bei der Sequenzanalyse der Lamintranskripte aus Lymphozyten von erkrankten Individuen konnten wir nur das Wildtyp-Allel detektieren, aber nicht das mutierte Allel, was darauf schließen ließ, dass das mutierte Allel m{\"o}glicherweise durch einen Kontrollmechanismus (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) degradiert wurde. Nach Inhibition des NMD durch Inkubation der Lymphozyten mit Cycloheximid oder Emetin, akkumulierte das mutierte Transkript wieder in der Zelle. Die Quantifizierung der Lamintranskripte durch Amplifi-kation mittels Real-Time-PCR zeigte eine deutliche Reduktion der Menge an Transkripten in Fi-broblasten von erkrankten Familienmitgliedern. Die Western-Blot-Analyse konnte eine reduzierte Expression von Lamin A und Lamin C best{\"a}tigen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Transkript mit dem PTC durch die NMD-Maschinerie degradiert wird und eine Haploinsuffizienz von Lamin A und Lamin C die DCM in dieser Familie verursacht.},
  subject      = {Kongestive Herzmuskelkrankheit},
  language  = {de}
}
@phdthesis{JurakBegonja2007,
  author    = {Jurak Begonja, Antonija},
  title     = {NO/cGMP and ROS Pathways in Regulation of Platelet Function and Megakaryocyte Maturation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21954},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Blutpl{\"a}ttchen spielen unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der H{\"a}mostase. So verhindern sie ein andauerndes Bluten von Wunden, indem sie in Blutgef{\"a}ssen zwischen normalen Zellen des Endothels und besch{\"a}digten Bereichen unterscheiden und sich dort gezielt anheften k{\"o}nnen. Das Zusammenspiel der Pl{\"a}ttchenagonisten und den dazugeh{\"o}rigen Rezeptoren wird durch intrazellul{\"a}re Signalmolek{\"u}le kontrolliert, die die Aktivierung der Blutpl{\"a}ttchen regulieren. {\"A}usserst wichtige intrazellulare Signalmolek{\"u}le stellen dabei die zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP dar, die bei der Hemmung der Pl{\"a}ttchen beteiligt sind. Die Bildung von cGMP und cAMP in den Blutpl{\"a}ttchen wird durch die aus dem Endothel freigesetzten Molek{\"u}le NO und Prostacyclin (PGI2) stimuliert, die ihrerseits Blutpl{\"a}ttchen hemmen, indem sie Proteinkinase G (PKG) und Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Neuerdings wird vorgeschlagen, dass es sich bei ROS („reactive oxygen species") um einen neuen Modulator bei der Signaltransduktion zwischen verschiedenen Zelltypen handelt. Die hier zusammengefasste Arbeit beschreibt die Rolle der ROS-Produktion bei der Aktivierung von Blutpl{\"a}ttchen, die Beziehung zwischen dem NO/cGMP/PKG I Signalweg und der ROS bzw. MAP-Kinase Signaltransduktion, und die Rolle von zyklischen Nukleotiden bei der Entwicklung von Megakaryozyten und Blutpl{\"a}ttchen. Werden Blutpl{\"a}ttchen durch unterschiedliche Einfl{\"u}sse aktiviert, so produzieren sie {\"u}ber die Aktivierung von NAD(P)H-Oxidase nur intrazellul{\"a}res aber nicht extrazellul{\"a}res ROS. Dabei beinflusst das in den Blutpl{\"a}ttchen produzierte ROS signifikant die Aktivierung von \&\#945;IIb\&\#946;3 Integrin, nicht jedoch die Sekretion von alpha- bzw. dichten Granula oder die Gestalt der Blutpl{\"a}ttchen. Die Thrombin-induzierte Integrin \&\#945;IIb\&\#946;3-Aktivierung ist nach Behandlung der Blutpl{\"a}ttchen mit Hemmstoffen der NAD(P)H-Oxidase oder Superoxid-F{\"a}ngern signifikant reduziert. Diese Inhibitoren reduzieren auch die Aggregation der Blutpl{\"a}ttchen bzw. die Thrombusbildung auf Kollagen, wobei diese Effekte unabh{\"a}ngig vom NO/cGMP Signalweg vermittelt werden. Sowohl ADP, das von dichten Granula der Blutpl{\"a}ttchen sezerniert wird und zur Aktivierung von P2Y12-Rezeptoren f{\"u}hrt, als auch die Freigabe von Thromboxan A2 stellen wichtige, vorgeschaltete Vermittler bei der p38 MAP Kinase-Aktivierung durch Thrombin dar. Jedoch spielt die p38 MAP-Kinase-Aktivierung keine signifikante Rolle bei der Thrombin-induzierten Kalzium-Mobilisierung, P-Selektin Exprimierung, \&\#945;IIb\&\#946;3 Integrin Aktivierung oder Aggregation der Blutpl{\"a}ttchen. Abschliessend kann festgestellt werden, dass sich die Aktivierung der PKG insgesamt klar hemmend auf die p38 and ERK MAP-Kinasen in menschlichen Blutpl{\"a}ttchen auswirkt. Desweiteren zeigt diese Studie, dass zyklische Nukleotide nicht nur die Blutpl{\"a}ttchen hemmen, sondern auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Megakaryozyten und Blutpl{\"a}ttchen haben, aber auf unterschiedliche Weise. cAMP ist an der Differenzierung von embryonalen h{\"a}matopoietischen Zellen zu Megakaryozyten beteiligt, wobei cGMP keine Rolle bei diesem Prozess spielt. W{\"a}hrend PKA in embryonalen Zellen schon vertreten ist, steigt beim Reifungsprozess der Megakaryozyten die Expression von Proteinen, die bei der cGMP Signalverbreitung („soluble guanylyl cyclase", sGC; PKG) mitwirken, stetig an. In der letzten Phase der Reifung von Megakaryozyten, die durch die Freisetzung der Blutpl{\"a}ttchen charakterisiert ist, zeigen cGMP und cAMP leicht divergierende Effekte: cGMP verst{\"a}rkt die Bildung von Blutpl{\"a}ttchen, w{\"a}hrend cAMP dieselbe reduziert. Dies deutet auf einen fein abgestimmten Prozess hin, abh{\"a}ngig von einem Stimulus, der von den benachbarten Zellen des Sinusoid-Endothels stammen k{\"o}nnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zu einen besseren Verst{\"a}ndnis der Regulation von Blutpl{\"a}ttchen sowie der m{\"o}glichen molekularen Mechanismen bei, die eine Rolle bei der Reifung von Megakaryozyten im vaskularen Mikroumfeld des Knochenmarks innehaben.},
  subject      = {Thrombozyt},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Reibetanz2006,
  author    = {Reibetanz, Konrad Joachim},
  title     = {Das prokoagulatorische Potential hoher Faktor XI-Spiegel bei der ven{\"o}sen Thromboembolie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18634},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Hoher Faktor XI stellt einen Risikofaktor der ven{\"o}sen Thrombose dar, {\"u}ber welchen Mechanismus hohe Faktor XI-Spiegel dabei thrombogen wirken ist noch weitestgehend unklar. Denkbar w{\"a}re eine Faktor XI-abh{\"a}ngige gesteigerte Thrombingenerierung. Andererseits ist eine gesteigerte Thrombingenerierung ein Merkmal von Patienten mit einer Faktor V Leiden-Mutation. Allerdings zeigen bei weitem nicht alle dieser Patienten eine Hyperkoagulabilit{\"a}t und nur ein Bruchteil davon wird jemals durch Thrombosen auff{\"a}llig. Entsprechend den Vorstellungen einer multifaktoriellen Thrombogenese war es daher unsere Vermutung, dass erh{\"o}hte Faktor XI-Spiegel bei bereits bestehender thrombophiler Gerinnungsst{\"o}rung die Thrombinbildung zus{\"a}tzlich triggern k{\"o}nnten und so das Risiko der Thromboseentstehung bei diesen Patienten weiter steigern. Zwei Patientengruppen nach ven{\"o}ser Thrombose wurden untersucht: 76 Faktor V Leiden-Tr{\"a}ger und 116 nicht-thrombophile Thrombosepatienten, alters- und geschlechtsgematchte Blutspender dienten als Kontrollen. Faktor XI, TAFIa/ai und F1+2-Spiegel wurden mittels ELISA, die Faktor V Leiden-Mutation, der Prothrombin-Polymorphismus, Faktor VIII, AT, PC und PS, sowie Antiphospholipid-Antik{\"o}rper mittels Routine-Assays bestimmt. Mit unseren Ergebnissen konnten wir zeigen, dass ein erh{\"o}hter Faktor XI-Spiegel keinen eigenst{\"a}ndigen Risikofaktor f{\"u}r die ven{\"o}se Thromboembolie darstellt, sondern seine thrombogene Wirkung erst im Zusammenwirken mit einer zugrunde liegenden Faktor V Leiden-Mutation erh{\"a}lt. Bei diesen Patienten scheint das mit hohen Faktor XI-Spiegeln assoziierte Thromboserisiko in einer beschleunigten Thrombinbildung und weniger in einer Faktor XI-abh{\"a}ngigen Fibrinpolysehemmung begr{\"u}ndet zu sein. Wir konnten daher Faktor XI als einen von der Faktor V Leiden-Mutation abh{\"a}ngigen, in seiner Auspr{\"a}gung moderaten Risikofaktor der Thrombose identifizieren. Dies steht in Einklang mit unseren Ergebnissen: Faktor XI nimmt bei diesen Patienten Einfluss auf die Thrombingenerierung, dar{\"u}ber hinaus jedoch nicht auf das fibrinolytische System.},
  language  = {de}
}