@phdthesis{Englberger2012,
  author    = {Englberger, Eva},
  title     = {Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Heisig2011,
  author    = {Heisig, Julia},
  title     = {Identifizierung neuer Zielgene der Hey bHLH Transkriptionsfaktoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65053},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Der Notch Signalweg spielt w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskul{\"a}ren Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) M{\"a}use und Hey1/HeyL Doppelknockout-M{\"a}use (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung w{\"a}hrend der Blutgef{\"a}ßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Auspr{\"a}gung der Hey KO Maus-Ph{\"a}notypen besser verstehen zu k{\"o}nnen. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpr{\"a}zipitation (ChIP) gew{\"a}hlt, um gleichzeitig einen {\"U}berblick {\"u}ber die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein {\"u}berexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach {\"U}berexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur f{\"u}r Hey2 15 Gene, die st{\"a}rker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antik{\"o}rper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Dom{\"a}ne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminos{\"a}ureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach {\"U}berexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgew{\"a}hlten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Dom{\"a}ne essentiell f{\"u}r die DNA-Bindung und f{\"u}r die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgef{\"u}hrt. F{\"u}r Hey1 wurden 1453 Zielgene, f{\"u}r Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 \%, bzw. 49 \% aller Bindungsstellen f{\"u}r Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. W{\"a}hrend 60 \% der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 \% der hochregulierten Gene Bindestellen f{\"u}r Hey2 auf. Dies spricht f{\"u}r eine {\"u}berwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 {\"u}berexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey {\"U}berexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgef{\"u}hrt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die {\"U}berlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen st{\"a}rker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe {\"U}berlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in fr{\"u}hen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren k{\"o}nnen. Weiterhin er{\"o}ffnen diese Daten neue M{\"o}glichkeiten f{\"u}r zuk{\"u}nftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der fr{\"u}hen Organentwicklung genauer ergr{\"u}nden.},
  subject      = {Gen notch},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schmidt2012,
  author    = {Schmidt, Traudel},
  title     = {Establishment of Hey-triple-KO-ES cells and characterisation of Bre, a Hey binding partner},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85459},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Hey1, Hey2 and HeyL are downstream effectors of the Notch signalling pathway. Hey genes play decisive roles during embryonic development for example in cardiovascular development. However, the precise transcriptional programmes and genes, which are affected by each single Hey gene, are still poorly understood. One drawback for the analysis of Hey1, Hey2 or HeyL single gene function is that these genes are co-expressed in many tissues and share a high degree of functional redundancy. Thus, it was necessary to establish a system, which is either devoid of Hey expression, or just comprises one single Hey gene family member. For this, Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- as well as Hey-triple- knock out (KO)-ES cells (embryonic stem cells) were generated in this work, because ES cells and their differentiation as EBs (embryoid bodies) represent a valuable tool for the in vitro analysis of embryonic developmental processes. After the establishment of Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells, it could be seen by ALP staining and pluripotency marker expression that loss of Hey expression did not affect ES cell pluripotency features. Thus, these ES cells represent bona fide ES cells and could be further used for the differentiation as EBs. Here, differences in gene expression between Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells (after the loss of Hey1) could be observed in realtime-RT-PCR analysis for the endodermal marker AFP as well as for neural and myogenic markers in d10 EBs. However, the establishment of inducible Hey1, Hey2 or HeyL ES cell lines will be essential to confirm these findings and to search for novel Hey target genes. To get further insight into the mode of Hey action, the analysis of Hey interaction partners is necessary. One such binding partner, the Bre protein, has previously been found in a yeast-two-hybrid screen. Bre has been described to be a member of two distinct complexes (i.e. the nuclear BRCA1-A complex with a function in DNA damage response and the cytoplasmic BRISC complex), to directly interact with the TNF-receptor and Fas and to interfere with apoptotic signalling. The Hey-Bre interaction could be further corroborated in this work; yet, it was not possible to narrow down the interaction site of Bre with Hey1. It rather seems that non-overlapping parts of the Bre protein may bind to Hey. This interaction may be direct- pointing to more than one interaction site inside the Bre protein - or via a common binding partner such as the endogenous Bre protein itself. Besides the interaction studies, functional assays were performed for a more detailed characterisation of Hey1 and Bre interaction. Here, it could be shown that Hey1 over-expression did not have any influence on Bre sub-cellular localisation. Interestingly, it could be demonstrated that Bre positively interfered with Hey1 repressive function in luciferase assays at three of four promoters analysed. Moreover, interaction with Bre seems to lead to a stabilisation of Hey1. As Bre has been described to modulate the E3-ligase activity intrinsic to the BRCC complex it was analysed whether Bre over-expression results in an ubiquitination of Hey1. Yet, this could not be observed in the present work. Furthermore, an interaction of Bre with ubiquitinated proteins could not be demonstrated in an ubiquitin binding assay. To obtain a better insight into Bre function, Bre LacZ gene trap-ES cells and animals were generated. However, realtime-RT-analyses revealed that these cells and mice did not show a loss of Bre expression on mRNA level indicating that insertion mutagenesis did not occur as expected. However, embryos derived from these mice could nevertheless be used for the detection of tissues with Bre expression by β-galactosidase staining. Bre deficiency on mRNA levels was only achieved after the deletion of the floxed exon 3 resulting in the generation of Bre del-mice. Bre del-mice were fertile and without any obvious phenotype and they were used for the generation of Bre del- and wt-MEFs (murine embryonic fibroblasts). Characterisation of these cells showed that proliferation was not affected after loss of Bre (neither under normal nor under stress conditions). However, loss of Bre notably resulted in a reduction in the BRCA1 DNA damage response, in a slightly increased sensitivity towards apoptosis induction by FasL treatment and in an increase in the K63-poly-ubiquitin content in Bre del-cytoplasmic fractions, probably linked to a change in the BRISC de-ubiquitinase activity. Even though these results have the same tendencies as observed in former studies, the effects in the present work are less striking. Further studies as well as intercrossing of Bre del- to Hey KO-animals will be necessary to further understand the functional relevance of Hey and Bre interaction.},
  subject      = {Embryonale Stammzelle},
  language  = {en}
}