@phdthesis{Ondrusch2010, author = {Ondrusch, Nicolai}, title = {Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52612}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellul{\"a}ren Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum f{\"u}r die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktions{\"a}quivalente f{\"u}r die Produktion von Desoxyribonucleotiden f{\"u}r die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen ver{\"a}ndert werden. In vielen F{\"a}llen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbr{\"u}cken f{\"u}hrt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgef{\"u}hrt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am st{\"a}rksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 -fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante h{\"o}her als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auff{\"a}llig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH ver{\"a}ndert war. Zu den am st{\"a}rksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen z{\"a}hlen lmo0135-7, sie codieren f{\"u}r einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren k{\"o}nnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zus{\"a}tzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auff{\"a}lligen Ph{\"a}notyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Ver{\"a}nderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zellul{\"a}re Hom{\"o}ostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollst{\"a}ndig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine n{\"a}here in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verst{\"a}rkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das urspr{\"u}nglich 253 Aminos{\"a}uren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verk{\"u}rzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu ver{\"a}ndern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuf{\"u}hren. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgef{\"u}hrt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 n{\"a}her aufzukl{\"a}ren. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgew{\"a}hlt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das f{\"u}r die allgemeine Stressantwort in Listerien zust{\"a}ndig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms" von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erh{\"o}ht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, w{\"a}hrend die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilit{\"a}t und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgekl{\"a}rt werden.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Claes2003, author = {Claes, Ellen}, title = {Einfluss funktionsloser Photorezeptoren auf die Anatomie der Retina - Eine licht- und elektronenmikroskopische Studie anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8181}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Netzhauterkrankungen, wie Retinitis pigmentosa, sind in der Bev{\"o}lkerung weit verbreitet (1,5 Millionen weltweit). Gew{\"o}hnlich berichten die Betroffenen {\"u}ber Nachtblindheit und periphere Gesichtsfeldausf{\"a}lle. H{\"a}ufig f{\"u}hrt diese Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren verursacht wird, zur vollst{\"a}ndigen Erblindung. Bisher beschrieb man den pathologischen Prozess vor allem an rd-M{\"a}usen. Allerdings setzt bei diesen die Degeneration sehr fr{\"u}h ein. Somit ist die {\"U}bertragbarkeit auf den Menschen erschwert, da abgesehen von wenigen Ausnahmen, der Verlust von Photorezeptoren hier erst im zweiten Lebensabschnitt beginnt. Deshalb war es interessant, im Rahmen dieser Arbeit anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus ein Modell zu untersuchen, das {\"a}hnlich dem menschlichen System, zun{\"a}chst eine intakte Morphologie zeigt. Dadurch war es m{\"o}glich eine genaue zeitliche Abfolge der Degeneration zu dokumentieren. Dies kann medizinisch zur Entwicklung eines Therapieansatzes genutzt werden, der bereits zu Beginn der Degeneration greift, und damit den fortlaufenden Prozess zum Stillstand bringen kann. Die CNGA3-/-Rho-/- Maus repr{\"a}sentiert ein System funktionsloser Photorezeptoren, bei dem der zyklische Nukleotid-Kanal (CNGA3) der Zapfenaußensegmente und das Rhodopsin (Rho) der St{\"a}bchenaußensegmente ausgeschaltet wurde. Best{\"a}tigt wurde dies durch ein Elektroretinogramm mit einer negativen Photoantwort bez{\"u}glich Zapfen und St{\"a}bchen. Die Degeneration f{\"u}hrt zu einem vollst{\"a}ndigen Verlust aller Photorezeptoren nach drei Monaten (Pm3). Zum Zeitpunkt Pw4 konnte, vergleichbar dem Wildtyp, eine intakte {\"a}ußere Retina nachgewiesen werden, bei der lediglich die {\"a}ußeren St{\"a}bchensegmente fehlen. Die synaptischen Kontakte zwischen den Terminalien der Photorezeptoren, der Horizontalzellen und Bipolarzelldendriten waren normal entwickelt und St{\"a}bchenendigungen als auch Zapfenendf{\"u}ßchen bildeten funktionelle Triaden aus. Bei den St{\"a}bchenendigungen konnte mit zunehmender Degeneration (Pw5, Pw6) eine Akkumulation synaptischer B{\"a}nder und postsynaptischer Elemente beobachtet werden. Im Zeitraum Pw4-7 zeigten sowohl die Zapfen, als auch die Horizontalzellen und St{\"a}bchen-Bipolarzellen, eine bemerkenswerte strukturelle Plastizit{\"a}t. Obwohl durch die Photorezeptoren kein Lichtsignal vermittelt wurde, konnten pr{\"a}synaptische Marker (bassoon) und postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluR1, mGluR6) an den Photorezeptorterminalien nachgewiesen werden. Dies l{\"a}sst die Vermutung zu, dass eine Transmitterfreisetzung theoretisch m{\"o}glich w{\"a}re. Dar{\"u}ber hinaus konnte im Zeitraum von 12 Monaten keine nennenswerte Auswirkung auf die IPL beobachtet werden: Amakrin- und Zapfen-Bipolarzellen waren normal stratifiziert und die Expression der Transmitter-Rezeptoren zeigte ein charakteristisches Verteilungsmuster. Außerdem war die Ultrastruktur von konventionellen und Bandsynapsen der des Wildtyps vergleichbar. Dar{\"u}ber hinaus bildeten sowohl Amakrinzellen, als auch Bipolar- und Ganglienzellen, Forts{\"a}tze in die INL hinein. Allgemein zeigt die immunhistochemisch und ultrastrukturell untersuchte CNGA3-/-Rho-/- Maus, dass weder funktionell aktive Photorezeptoren noch Licht eine stimulierende Wirkung auf die Ausbildung synaptischer Strukturen und die Expression verschiedener Rezeptoren haben.}, subject = {Netzhaut}, language = {de} }