@phdthesis{Keller2004,
  author    = {Keller, Sascha},
  title     = {Struktur- und Funktionsanalysen an BMP Ligand-Rezeptor-Komplexen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12467},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {F{\"u}r BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembran{\"a}rer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage f{\"u}r das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis f{\"u}r die Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierf{\"u}r wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Aufl{\"o}sung von 1,9{\AA} ermittelt. Mit der h{\"o}heren Aufl{\"o}sung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen in der Interaktionsfl{\"a}che zwischen BMP-2 und BR-IAec m{\"o}glich. Deren zentrale Bedeutung f{\"u}r dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse best{\"a}tigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfl{\"a}che liegenden Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Br{\"u}cke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Dar{\"u}ber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Pr{\"a}-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermolek{\"u}le f{\"u}r die Anpassung der Bindungsfl{\"a}che an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage f{\"u}r ein neues Modell zur Beschreibung von Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, w{\"a}hrend die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfl{\"a}che die Bildung von Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen energetisch beg{\"u}nstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringf{\"u}gigen Einfluss auf die Affinit{\"a}t nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Pr{\"a}paration und Kristallisation von bin{\"a}ren Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen f{\"u}r BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der tern{\"a}ren Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der hierf{\"u}r verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abh{\"a}ngigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinit{\"a}ten ermittelt werden konnten. In {\"U}bereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe f{\"u}r BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex pr{\"a}pariert. Des Weiteren konnte die Bildung des tern{\"a}ren BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in L{\"o}sung nachgewiesen werden. F{\"u}r all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualit{\"a}t der erhaltenen Kristalle nicht f{\"u}r eine Aufkl{\"a}rung der Struktur aus. F{\"u}r eine detailliertes Verst{\"a}ndnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgef{\"u}hrt werden. Die pr{\"a}sentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass {\"u}ber die Kenntnis der einzelnen Affinit{\"a}ten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe m{\"o}glich ist.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hassel2005,
  author    = {Haßel, Sylke},
  title     = {Signal transduction via multiple BMP receptor complexes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13353},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {BMPs influence a variety of cellular processes. They have been shown to regulate proliferation, differentiation, migration and apoptosis and thus play central roles during developmental processes and tissue homeostasis. Ligand mediated signal transduction is transmitted via BMP type I and BMP type II receptors, both members of the serine/threonine kinase superfamily. The BMP receptor mediated signal transduction is not explored in detail. Therefore our aim was to address different aspects of BMP mediated signal transduction with main focus on BRII and its regulation. Due to the existence of two alternative splice variants, a long and a short form, the function of the two variants and the impact of the C-terminal extension are of general interest. Moreover, mutations in the BMPR2 gene were identified to be responsible for PPH, a autosomal dominant lung disease. In this thesis, BRII phosphorylation and signalling mediated by different receptor oligomers were investigated and multiple BRII associated proteins were identified. We could show that the oligomerization pattern of BMP receptors exhibits a higher degree of flexibility compared to other receptors of that superfamily. In the present work the BMP2 mediated signal transduction should be examined, depending on the receptor oligomerization pattern. Using kinase-deficient mutants, it could be demonstrated, that signalling via preformed BMP receptor complexes is mediated by the well characterized Smad1/5/8 pathway, whereas signalling initiated by BMP2 induced recruitment of the receptors activates the p38 pathway and leads to Alkaline Phosphatase production. To further study signalling events triggered directly from the BRII a proteomics-based screen for BRII associated proteins was performed. 53 associated proteins were found, the majority being signal transducing molecules, but in addition metabolic proteins, transcriptional regulators and others were identified. These proteins enable to gain a deeper insight in BMP mediated signalling. One of the interactors, the receptor tyrosine kinase c-kit, was characterized in more detail. It could be demonstrated, that BRII and c-kit form a complex in vitro and in vivo, and the interaction is enhanced upon BMP2 stimulation. 2D phosphopeptid mapping showed that BRII is phosphorylated at S757 upon activation of c-kit by SCF. Moreover, c-kit and its ligand SCF are modulating BMP2 pathways, by enhancing Smad1/5 phosphorylation, Smad-transcriptional activity, Alkaline Phosphatase production and expression of Cbfa1. All these pathways hint towards modulation of the osteoblast development via c-kit. Thus, we were able to develop a novel paradigm for the BMP2 meditated signalling. One of the initial triggers for BRII is the auto-phosphorylation of BRII. Here we analyze ligand-independent as well as ligand-dependent phosphorylation of BRII. Some phosphorylation sites in BRII were identified. The general phosphorylation occurs mostly on serines. S815, S818 and Y825 are identified targets of phosphorylation whose function is still unclear. However phosphorylation of S336 is demonstrated to be essential for BRII activation. The elucidation of BMP receptor phosphorylation and oligomerization as well as the impact of a number of BRII associated proteins (such as c-kit), demonstrated in this thesis that BMP signalling has to be regulated precisely on multiple levels. This can be useful for the development of selective signalling inhibitors for basic research and therapeutic approaches of PPH and other diseases.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hartung2006,
  author    = {Hartung, Anke},
  title     = {Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18360},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Weber2006,
  author    = {Weber, Dionys A.},
  title     = {Aufkl{\"a}rung der Struktur und Charakterisierung des tern{\"a}ren Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20735},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {„Bone Morphogenetic Proteins" (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehom{\"o}ostase. Wie TGF­-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. F{\"u}r die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Pr{\"a}paration, Kristallisation und Strukturaufkl{\"a}rung des tern{\"a}ren Komplexes aus BMP-2 und den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses tern{\"a}ren Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 pr{\"a}sentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Rezeptoren k{\"o}nnen keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativit{\"a}t bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erkl{\"a}rbar. Vielmehr repr{\"a}sentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativit{\"a}t {\"u}ber die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgef{\"u}hrten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. W{\"a}hrend polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbr{\"u}cke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinit{\"a}t, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminos{\"a}uren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen {\"u}ber den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifit{\"a}t m{\"o}glich. Diese BMP-2 Varianten k{\"o}nnen als Werkzeuge zur Aufkl{\"a}rung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso w{\"a}re es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgepr{\"a}gter Typ II Rezeptor Spezifit{\"a}t in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise k{\"o}nnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kotzsch2008,
  author    = {Kotzsch, Alexander},
  title     = {BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquit{\"a}re, sekretierte Proteine mit vielf{\"a}ltigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellul{\"a}ren Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhom{\"o}ostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt - und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signal{\"u}bermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-\&\#946;s und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen - Typ I und Typ II - existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen f{\"u}r die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verf{\"u}gung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuit{\"a}t {\"u}ben BMPs ihre biologische Funktion {\"u}berwiegend hochspezifisch aus, d.h. abh{\"a}ngig vom Liganden werden spezifische zellul{\"a}re Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellul{\"a}rer Signalkaskaden zusammenh{\"a}ngen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals", repr{\"a}sentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere {\"u}bermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel f{\"u}r Bindungspromiskuit{\"a}t und -spezifit{\"a}t. W{\"a}hrend BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinit{\"a}t bindet („promiske Interaktion"), zeigt GDF-5 eine 15-20fach h{\"o}here Bindungsaffinit{\"a}t zu BMPR-IB („spezifische" Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch {\"u}beraus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden bin{\"a}re und tern{\"a}re Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilit{\"a}t auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung n{\"a}her zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgekl{\"a}rt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. W{\"a}hrend in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinit{\"a}t bestimmt, tr{\"a}gt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit" vorliegt und die Molek{\"u}le entsprechend „aufeinander falten". (2) Die Bindungsspezifit{\"a}t wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, f{\"u}hrt erst die „richtige" Kombination aus Flexibilit{\"a}t in den Schleifen und Rigidit{\"a}t des Rezeptorgrundger{\"u}sts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplement{\"a}ren Oberfl{\"a}che. Die mangelnde sterische Komplementarit{\"a}t von Ligand- und Rezeptoroberfl{\"a}chen f{\"u}hrt zu der niedrigeren Bindungsaffinit{\"a}t von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgel{\"o}sten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne, das Transmembransegment und die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedom{\"a}nen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. M{\"o}glicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedom{\"a}nen der Typ I und Typ II Rezeptoren f{\"u}r eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren m{\"o}glicherweise vom Liganden abh{\"a}ngt. Angesichts der Bindungspromiskuit{\"a}t unter BMP-Liganden und -Rezeptoren k{\"o}nnten so spezifische Signale {\"u}bermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion m{\"o}glich ist, kann nun f{\"u}r die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.},
  subject      = {Cytokine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Heinecke2010,
  author    = {Heinecke, Kai},
  title     = {Die Dynamik der prim{\"a}ren Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor \&\#946; (TGF-\&\#946;) die Transforming Growth Factor \&\#946;-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im n{\"a}chsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und f{\"u}nf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuit{\"a}t in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen l{\"a}sst. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ {\"a}hnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne, einer Transmembrandom{\"a}ne sowie einer intrazellul{\"a}ren Kinasedom{\"a}ne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen f{\"u}hrt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene ausl{\"o}sen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilit{\"a}t der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass f{\"u}r die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden n{\"o}tig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalit{\"a}t der verschiedenen Rezeptordom{\"a}nen in der Signal{\"u}bermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedom{\"a}ne abh{\"a}ngig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abh{\"a}ngig ist.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Harth2010,
  author    = {Harth, Stefan},
  title     = {Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand's point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors' point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Ulbrich2010,
  author    = {Ulbrich, Jannes},
  title     = {Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {BMPs vermitteln ihre zellul{\"a}ren Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranst{\"a}ndiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfl{\"a}che sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivit{\"a}t der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zug{\"a}nglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinit{\"a}t zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen erm{\"o}glichten. Die BMP Rezeptorektodom{\"a}nen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodom{\"a}nen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schul2013,
  author    = {Schul, Daniela},
  title     = {Spatio-temporal investigation and quantitative analysis of the BMP signaling pathway},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-84224},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are key regulators for a lot of diverse cellular processes. During embryonic development these proteins act as morphogens and play a crucial role particularly in organogenesis. BMPs have a direct impact on distinct cellular fates by means of concentration-gradients in the developing embryos. Using the diverse signaling input information within the embryo due to the gradient, the cells transduce the varying extracellular information into distinct gene expression profiles and cell fate decisions. Furthermore, BMP proteins bear important functions in adult organisms like tissue homeostasis or regeneration. In contrast to TGF-ß signaling, currently only little is known about how cells decode and quantify incoming BMP signals. There is poor knowledge about the quantitative relationships between signal input, transducing molecules, their states and location, and finally their ability to incorporate graded systemic inputs and produce qualitative responses. A key requirement for efficient pathway modulation is the complete comprehension of this signaling network on a quantitative level as the BMP signaling pathway, just like many other signaling pathways, is a major target for medicative interference. I therefore at first studied the subcellular distribution of Smad1, which is the main signal transducing protein of the BMP signaling pathway, in a quantitative manner and in response to various types and levels of stimuli in murine c2c12 cells. Results indicate that the subcellular localization of Smad1 is not dependent on the initial BMP input. Surprisingly, only the phospho-Smad1 level is proportionally associated to ligand concentration. Furthermore, the activated transducer proteins were entirely located in the nucleus. Besides the subcellular localization of Smad1, I have analyzed the gene expression profile induced by BMP signaling. Therefore, I examined two endogenous immediate early BMP targets as well as the expression of the stably transgenic Gaussia Luciferase. Interestingly, the results of these independent experimental setups and read-outs suggest oscillating target gene expression. The amplitudes of the oscillations showed a precise concentration-dependence for continuous and transient stimulation. Additionally, even short-time stimulation of 15' activates oscillating gene-expression pulses that are detectable for at least 30h post-stimulation. Only treatment with a BMP type I receptor kinase inhibitor leads to the complete abolishment of the target gene expression. This indicated that target gene expression oscillations depend directly on BMP type I receptor kinase activity.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {en}
}