@phdthesis{Seubert2010,
  author    = {Seubert, Carolin},
  title     = {Onkolytische Virotherapie : Virus-vermittelte Expression von MCP-1 oder ß-Galaktosidase in Vaccinia-Virus-kolonisierten Tumoren f{\"u}hrt zu einer erh{\"o}hten Tumorregression},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48083},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollst{\"a}ndige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und f{\"u}hrten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei m{\"o}gliche Therapieans{\"a}tze zur Verst{\"a}rkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivit{\"a}tssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs f{\"u}hren. Dar{\"u}ber hinaus diente das f{\"u}r MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen f{\"u}hrte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivit{\"a}t in Zelllysaten und Zellkultur-{\"U}berst{\"a}nden zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellul{\"a}r assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. -{\"u}berst{\"a}nden und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation f{\"u}hrte zur Abt{\"o}tung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Ver{\"a}nderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug f{\"u}hrte zu starken Synergieeffekten bei der Abt{\"o}tung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen best{\"a}tigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrang{\"a}ngigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs {\"u}ber den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-M{\"a}usen durchgef{\"u}hrte Replikationsanalysen und X-Gal-F{\"a}rbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere f{\"u}hrte, konnte eine systemische Toxizit{\"a}t außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber der onkolytischen Aktivit{\"a}t von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. W{\"a}hrend einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unver{\"a}ndertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), f{\"u}hrt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollst{\"a}ndigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegen{\"u}ber mononukle{\"a}rer Zellen aus und f{\"u}hrt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zun{\"a}chst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalst{\"a}rke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensit{\"a}t verlor. Toxizit{\"a}t und sch{\"a}dliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter M{\"a}use nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression f{\"u}hrte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo f{\"u}hrte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine f{\"u}r therapeutische Effekte erw{\"u}nschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression best{\"a}tigt werden. Die funktionelle Aktivit{\"a}t des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-\&\#945;-spezifischer ELISA-Analysen {\"u}berpr{\"u}ft. Dabei zeigte sich eine erh{\"o}hte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlfl{\"a}chenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese ver{\"a}nderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion l{\"a}sst auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion f{\"u}hrte nach einer anf{\"a}nglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verst{\"a}rkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell f{\"u}hrten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verst{\"a}rkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 f{\"u}hrten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch k{\"u}nftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, k{\"o}nnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zus{\"a}tzliche Verst{\"a}rkung der Effekte erzielt und m{\"o}glicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen erm{\"o}glicht werden.},
  subject      = {Vaccinia-Virus},
  language  = {de}
}