@phdthesis{Wulf2001,
  author    = {Wulf, Andrea},
  title     = {Regulierung eines kalziumempfindlichen Kaliumkanals durch Proteinkinase C},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1179144},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Ca2+-empfindliche K+-Kan{\"a}le mittlerer Leitf{\"a}higkeit (IK1-Kan{\"a}le) {\"u}bernehmen wichtige Funktionen bei vielen physiologischen Prozessen wie z.B. bei der Zell-Proliferation, der epithelialen Salz- und Wasser-Sekretion und der Zellmigration. Die Kan{\"a}le werden durch die intrazelul{\"a}re Ca2+-Konzentration reguliert, wobei ihre Ca2+-Sensitivit{\"a}t durch Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des aus transformierten Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) klonierten Ca2+-sensitiven K+-Kanals mittlerer Leitf{\"a}higkeit (cIK1) und die Untersuchung seiner Regulierung durch die Proteinkinase C (PKC). Dazu wurde der Kanal heterolog in CHO- und HEK293-Zellen exprimiert. Seine biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie der Einfluß der Proteinkinase C auf die Kanalaktivit{\"a}t wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die cIK1-Str{\"o}me sind schwach einw{\"a}rtsrektifizierend, zeigen keine Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetik und weisen im physiologischen Bereich keine Spannungsabh{\"a}ngigkeit auf. Der cIK1 ist K+-selektiv und wird durch einen Anstieg der intrazellul{\"a}ren Ca2+-Konzentration aktiviert. Der Kanal wird durch Barium, Charybdotoxin und Clotrimazol blockiert und durch 1-Ethyl-2-Benzimidazolon aktiviert. Die funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften des klonierten cIK1 entsprechen damit denen des nativen Kanals aus MDCK-F-Zellen und stimmen mit denen anderer Mitglieder der IK1-Kanalfamilie {\"u}berein. Neben der Regulierung durch die intrazellul{\"a}re Ca2+-Konzentration wird der cIK1 auch durch eine PKC-abh{\"a}ngige Phosphorylierung reguliert. Sowohl ATP als auch ATP?S stimulieren die Kanalaktivit{\"a}t. Die ATP-abh{\"a}ngige Aktivierung wird durch Inhibitoren der Proteinkinase C (Bisindolylmaleimid, Calphostin C) gehemmt, w{\"a}hrend die mit ATP?S induzierte Kanalaktivit{\"a}t weitgehend resistent gegen diese PKC-Inhibitoren ist. Eine Stimulierung der Proteinkinase C mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) f{\"u}hrt zu einer sofortigen Aktivierung des cIK1. Im Gegensatz dazu sind die cIK1-Kan{\"a}le nach fast vollst{\"a}ndigem Abbau der Proteinkinase C durch eine langfristige Inkubierung der Zellen mit PMA nicht mehr aktiv. Um zu untersuchen, ob diese Regulierung eine direkte Interaktion der Proteinkinase C mit dem Kanalprotein erfordert, wurden die drei putativen PKC-Konsensussequenzen des cIK1 mittels zielgerichteter Mutagenese so ver{\"a}ndert, daß eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr m{\"o}glich ist. Weder die einzelne Mutation der PKC-Konsensussequenzen (T101, S178, T329) noch die gleichzeitige Mutation aller drei Phosporylierungsstellen zu Alanin beeinflußt die akute Regulierung des cIK1 durch die Proteinkinase C. Die cIK1-Mutante T329A und die Dreifachmutante reagieren jedoch nach einem Abbau der Proteinkinase C mit einem extremen Anstieg der Kanalaktivit{\"a}t und demaskieren damit einen zweiten Weg der Kanalregulierung. Die Ergebnisse zeigen, daß der cIK1 durch zwei voneinander unabh{\"a}ngige Mechanismen reguliert wird. Eine PKC-abh{\"a}ngige Phosphorylierung erh{\"o}ht die Aktivit{\"a}t der Kan{\"a}le, findet jedoch nicht an den bekannten PKC-Konsensusesquenzen des Kanalproteins statt. Dagegen werden die cIK1-Kan{\"a}le {\"u}ber einen zweiten ATP-abh{\"a}ngigen Mechanismus, der wahrschenlich eine direkte Interaktion mit dem Kanalprotein erfordert, gehemmt.},
  subject      = {Kaliumkanal},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Riemensperger2006,
  author    = {Riemensperger, Thomas},
  title     = {Untersuchung pr{\"a}diktiver Eigenschaften des dopaminergen Systems von Drosophila melanogaster mittels genetisch kodierter Calcium Sensoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19041},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren erm{\"o}glicht es, Messungen neuraler Aktivit{\"a}ten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuf{\"u}hren. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verh{\"a}ltnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Aufl{\"o}sung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkul{\"a}r permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molek{\"u}l basieren, wobei das Signal auf einer ver{\"a}nderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivit{\"a}ten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich f{\"u}r die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierf{\"u}r wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. W{\"a}hrend die calciumabh{\"a}ngigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel gr{\"o}ßer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verh{\"a}ltnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund f{\"u}r die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung f{\"u}hren, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem urspr{\"u}nglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegen{\"u}ber {\"a}ndert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Ged{\"a}chtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzk{\"o}rper von essentieller Bedeutung f{\"u}r die Ausbildung eines olfaktorischen Ged{\"a}chtnisses sind. W{\"a}hrend das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist {\"u}ber die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzk{\"o}rper schwach auf die Pr{\"a}sentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock w{\"a}hrend eines Trainings, verl{\"a}ngert sich die Aktivit{\"a}t dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, w{\"a}hrend die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Ver{\"a}nderungen aufweist. W{\"a}hrend bei S{\"a}ugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorg{\"a}ngen {\"u}ber dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution ge{\"a}ndert zu haben scheint, die F{\"a}higkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verst{\"a}rkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu k{\"o}nnen, zwischen S{\"a}ugern und Drosophila erhalten.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Endter2008,
  author    = {Endter, J{\"o}rg-Michael},
  title     = {Mechanismen der Elektropermeabilisierung und Elektrofusion eukaryotischer Zellen und Protoplasten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29647},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {In dieser Arbeit konnten grundlegende Erkenntnisse {\"u}ber die Wirkung elektrischer Felder auf Membranen von eukaryotischen Zellen gewonnen werden. Dieses Wissen erm{\"o}glichte eine detaillierte Aufkl{\"a}rung der Mechanismen der Elektropermealisierung und der Elektrofusion. Maßgeblich hierf{\"u}r war die dielektrische Analyse von Pflanzen- bzw. Hefeprotoplasten durch umfassende Messungen auf Basis der Elektrorotationsmethode. Mithilfe dieser Methode wurden die elektrischen Eigenschaften wie die fl{\"a}chenspezifische Membrankapazit{\"a}t und die innere Leitf{\"a}higkeit von Pichia pastoris Protoplasten ermittelt. Die Kenntnis dieser Zelleigenschaften verhalf dazu, einerseits das Sammelfeld im Hinblick auf seine Feldst{\"a}rke und Frequenz einzustellen. Damit wurde ein optimaler Kontakt der Zellmembranen w{\"a}hrend der Fusion erm{\"o}glicht und st{\"o}rende Einfl{\"u}sse, wie beispielsweise die Multizellrotation, minimiert. Anderseits wurde der Durchbruchpuls bez{\"u}glich der Pulsl{\"a}nge und der Feldst{\"a}rke den Anforderungen f{\"u}r die Elektrofusion der relativ kleinen Protoplasten angepasst. In Folge dessen war es m{\"o}glich, ein Protokoll zur Herstellung von Riesenzellen aus Pichia pastoris Protoplasten zu erstellen. Diese Erkenntnisse sind besonders interessant, da der Einsatz von Riesenzellen die Erforschung der aktiven elektrischen Eigenschaften von Zellmembranen durch kombinierte Anwendung intrazellul{\"a}rer Mikroelektroden mit etablierten elektrophysiologischen Techniken erm{\"o}glicht. Als Beispiele seien hier „current-„ und „voltage-clamp", „patch clamp" sowie die Ladungspulsmethode genannt. Die erhebliche Vergr{\"o}ßerung der Membranoberfl{\"a}che bei Riesenzellen f{\"u}hrt zu einer Erh{\"o}hung der Gesamtzahl von Membranproteinen wie beispielsweise Transmembrankan{\"a}le. Daher kann erwartet werden, dass kanalvermittelte Signale deutlich st{\"a}rker ausfallen und ihre Untersuchungen erleichtert werden. Die komplexen Ergebnisse der Elektrorotation von vakuolisierten BY-2 Protoplasten konnten sehr genau mit Hilfe des Dreischalenmodells erkl{\"a}rt werden, welches die Struktur der pflanzlichen Zellen, insbesondere die zwei seriell geschalteten Kapazit{\"a}ten des Plasmalemmas und des Tonoplasten, ber{\"u}cksichtigt. Die Anwendung dieses Modells erlaubte eine getrennte Berechnung der Potentialprofile {\"u}ber das Plasmalemma (Up) und den Tonoplasten (Ut), welche durch einen kurzen Gleichstrompuls induziert wurden. Anhand dieser Potentialprofile war es m{\"o}glich, die Abh{\"a}ngigkeit des Ca2+-Einstromes in das Cytoplasma aus der Vakuole oder dem extrazellul{\"a}ren Raum vom applizierten elektrischen Feld und der externen Leitf{\"a}higkeit zu erkl{\"a}ren. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aufladung des Plasmalemmas und des Tonoplasten und daraus folgend der elektrischen Membrandurchbruch der jeweiligen Membran stark von der externen Leitf{\"a}higkeit abh{\"a}ngen. Die Tatsache, dass elektrische Pulssequenzen von niedriger Intensit{\"a}t einen erhebliche Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirken k{\"o}nnen und sich durch Modulation ihrer Amplitude reizspezifische Ca2+-Signaturen simulieren lassen, er{\"o}ffnet eine schonende M{\"o}glichkeit zur Untersuchung von Ver{\"a}nderungen des cytosolischen Ca2+-Spiegels unabh{\"a}ngig von persistierenden exogenen Stimuli. Da Ca2+ in Pflanzen ein wichtiger „second messenger" ist, bieten sich elektrische Felder als neues wirksames Werkzeug zur Kontrolle zellinterne Signalwege f{\"u}r die Grundlagenforschung sowie f{\"u}r Anwendungen in der Biotechnologie, wie beispielsweise Elektrotransfektion und -fusion, an. Als wichtige Konsequenz kann aus den hier gewonnen Erkenntnissen gezogen werden, dass Behandlungen pflanzlicher Zellen mit elektrischen Feldern in niedrig leitende Medien durchgef{\"u}hrt werden, um eine minimale Freisetzung von Ca2+ und anderen Inhaltstoffen aus der Vakuole zu gew{\"a}hrleisten.},
  subject      = {Elektrofusion},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Voeller2009,
  author    = {V{\"o}ller, Thomas},
  title     = {Visualisierung und Manipulation neuronaler Aktivit{\"a}ten im Gehirn von Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35589},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivit{\"a}t entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repr{\"a}sentation der Duftidentit{\"a}t und der Duftintensit{\"a}t untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente f{\"u}hrten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivit{\"a}tsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivit{\"a}tsmuster der pr{\"a}sentierten D{\"u}fte zeigten interessanterweise einen hohen {\"A}hnlichkeitsgrad, wohingegen andere un{\"a}hnlich waren. In h{\"o}heren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzk{\"o}rper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilit{\"a}t der duftevozierten Aktivit{\"a}tsmuster vor, was generelle Interpretationen unm{\"o}glich macht und h{\"o}chstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zul{\"a}sst. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie pr{\"a}- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erh{\"o}hung der Konzentration der verschiedenen pr{\"a}sentierten D{\"u}fte {\"u}ber einen Bereich von mindestens drei Gr{\"o}ßenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzk{\"o}rper-Calyx und der Pilzk{\"o}rper-Loben ist diese Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit weniger deutlich ausgepr{\"a}gt und im Falle der Loben nur f{\"u}r bestimmte D{\"u}fte detektierbar. Eine Best{\"a}tigung des postulierten „sparsed code" der Duftpr{\"a}sentation in den Pilzk{\"o}rpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was m{\"o}glicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellaufl{\"o}sung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabh{\"a}ngigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verst{\"a}rkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz f{\"u}r einen aversiven Reiz f{\"u}hrte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Ged{\"a}chtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz f{\"u}r einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Ged{\"a}chtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}