@phdthesis{Endt2015,
  author    = {Endt, Daniela},
  title     = {Fanconi An{\"a}mie : Entwicklung von h{\"a}matopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Zur Wahrung der Genomstabilit{\"a}t entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen f{\"u}hren. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi An{\"a}mie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilit{\"a}t f{\"u}hren. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erh{\"o}hten Tumor-raten und An{\"a}mien gepr{\"a}gt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als urs{\"a}chlich f{\"u}r diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens k{\"o}nnen nur begrenzt R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die Auspr{\"a}-gung des Ph{\"a}notyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgepr{\"a}gtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung hierf{\"u}r liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem f{\"u}hrt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „nat{\"u}rlichen Gentherapie" wurde bei 10-30\% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. F{\"u}r die weiteren Patienten f{\"u}hrten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. N{\"a}here Analysen best{\"a}tigten f{\"u}r die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer R{\"u}ckmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der N{\"a}he eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einsch{\"a}tzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrj{\"a}hrigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, H{\"a}moglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgef{\"u}hrt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erh{\"o}hten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen f{\"u}r eine starke Reversion. Zur besseren Absch{\"a}tzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgef{\"u}hrt. Die Detektionsgrenze f{\"u}r FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30\% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden f{\"u}r die vier Patienten Reversionen von 0\% (Pat. 4) bis 90-95\% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien erm{\"o}glichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgepr{\"a}gten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) h{\"o}here Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien l{\"a}sst eine Reversion in einer gemeinsamen Vorl{\"a}uferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). H{\"a}ufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir f{\"u}r alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden best{\"a}tigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Absch{\"a}tzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden. Ein weiteres Projekt besch{\"a}ftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen best{\"a}tigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex f{\"u}hren. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Auspr{\"a}gung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu erm{\"o}glichen und zus{\"a}tzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gef{\"o}rdert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe f{\"u}r die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zus{\"a}tzlich fanden wir Hinweise auf m{\"o}gliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangl{\"a}sionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Sch{\"a}den un-tersucht. Diese f{\"u}hrten innerhalb der Subkomplexe zu gegens{\"a}tzlichen {\"A}nderungen der Interaktionsinten-sit{\"a}t. W{\"a}hrend die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsst{\"a}rke f{\"u}hrte, erh{\"o}hte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. M{\"o}glicherweise w{\"u}rde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gef{\"o}rdert werden. Zus{\"a}tzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, {\"u}berpr{\"u}ft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsst{\"a}rke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins. Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufkl{\"a}rung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine f{\"u}r eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3'-/ 5'-{\"U}berhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3'-{\"U}berhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse k{\"o}nnte in weiterf{\"u}hrenden Analysen zur Absch{\"a}tzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb},
  subject      = {Fanconi An{\"a}mie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bertho2016,
  author    = {Bertho, Sylvain},
  title     = {Biochemical and molecular characterization of an original master sex determining gene in Salmonids},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-139130},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Sexual development is a fundamental and versatile process that shapes animal morphology, physiology and behavior. The underlying developmental process is composed of the sex determination and the sex differentiation. Sex determination mechanisms are extremely labile among taxa. The initial triggers of the sex determination process are often genetics called sex determining genes. These genes are expressed in the bipotential gonad and tilt the balance to a developmental program allowing the differentiation of either a testis or an ovary. Fish represent a large and fascinating vertebrate group to study both sex determination and sex differentiation mechanisms. To date, among the known sex determining genes, three gene families namely sox, dmrt and TGF-β factors govern this developmental program. As exception to this rule, sdY "sexually dimorphic on the Y" does not belong to one of these families as it comes from the duplication / evolution of an ancestor gene related to immunity, i.e., the interferon related factor 9, irf9. sdY is the master sex determining gene in salmonids, a group of fishes that include species such as rainbow trout and Atlantic salmon. The present study was aimed to firstly characterize the features of SdY protein. Results indicate that SdY is predominantly localized in the cytoplasm tested in various fish and mammalian cell lines and confirmed by different methods. Predictive in silico analysis revealed that SdY is composed of a β-sandwich core surrounded by three α-helices as well specific characteristics conferring a putative protein-protein interaction site. Secondly, the study was aimed to understand how SdY could trigger testicular differentiation. SdY is a truncated divergent version of Irf9 that has a conserved protein-protein domain but lost the DNA interaction domain of its ancestor gene. It was then hypothesized that SdY could initiate testicular differentiation by protein-protein interactions. To evaluate this we first conducted a yeast-two-hybrid screen that revealed a high proportion of transcription factors including fox proteins. Using various biochemical and cellular methods we confirm an interaction between SdY and Foxl2, a major transcription factor involved in ovarian differentiation and identity maintenance. Interestingly, the interaction of SdY with Foxl2 leads to nuclear translocation of SdY from the cytoplasm. Furthermore, this SdY translocation mechanism was found to be specific to fish Foxl2 and to a lesser extend Foxl3 and not other Fox proteins or mammalian FoxL2. In addition, we found that this interaction allows the stabilization of SdY and prevents its degradation. Finally, to better decipher SdY action we used as a model a mutated version of SdY that was identified in XY females of Chinook salmon natural population. Results show that this mutation induces a local conformation defect obviously leading to a misfolded protein and a quick degradation. Moreover, the mutated version compromised the interaction with Foxl2 defining a minimal threshold to induce testicular differentiation. Altogether results from my thesis propose that SdY would trigger testicular differentiation in salmonids by preventing Foxl2 to promote ovarian differentiation. Further research should be now carried out on how this interaction of SdY and Foxl2 acts in-vivo.},
  subject      = {Lachsartige <Familie>},
  language  = {en}
}