@phdthesis{Streit2004, author = {Streit, Sebastian}, title = {Automatische Identifizierung bei sozialen Insekten : Design und Praxistest}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8962}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Design und Implementierung eines RFID basierten Systems f{\"u}r soziale Insekten (Hummeln, Bienen)}, subject = {Soziale Insekten}, language = {de} } @phdthesis{Rapp2004, author = {Rapp, Ulrike}, title = {Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9096}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {en} } @phdthesis{Reintjes2004, author = {Reintjes, Norbert}, title = {Taxonomy, faunistics and life-history traits of Dytiscidae and Noteridae (Coleoptera) in a West African savannah}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10287}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {The studies inventoried the species of the families Dytiscidae and Noteridae (Coleoptera) in Como{\´e} National Park in northern Ivory Coast, West Africa and investigated the ecological role of temporary and permanent water bodies for the aestivation of these aquatic beetles. The ecological studies focused on the question how the beetles cope with the temporary loss of their aquatic habitats during dry season. The climate in the study area is characterised by a pronounced dry season from about November to March/April, in which the temporary ponds and creeks in the savannah entirely desiccate. The only available water bodies during dry season in Como{\´e} National Park are the Como{\´e} River, pools in some of its tributaries, and a few of the large savannah ponds. The taxonomic and faunistic analysis revealed a high species richness in the study area and yielded a total of twelve species of Noteridae in four genera and 95 species of Dytiscidae in 22 genera. Thirty of these species had not yet been reported from the Ivory Coast. A description of a new species in the genus Laccophilus is given, named L. comoensis in honour of the National Park. Strong incidences exist that the material includes more species yet unknown to science. Concerning the mode of aestivation, observations in pilot studies led to the working hypothesis that the beetles pass the dry season as adults in aquatic habitats. Consequently, presence of adults in aquatic habitats throughout the dry season and cyclic migration of adults between temporary and permanent water bodies was expected. Regular sampling of water bodies throughout the dry season and beginning rainy season yielded 33,705 individuals in 72 species and 26 genera. In all the sample periods Noteridae and / or Dytiscidae were recorded. The number of species per period was between 36 and 58. It is concluded that in Como{\´e} National Park a) at least parts of the populations of the recorded species pass the dry season as adults and b) aquatic habitats serve as a refuge for aestivation of these adult beetles. In a rocky area in the riverbed of the permanent Como{\´e} River four sets of studies were performed during dry and beginning rainy season. According to the working hypothesis beetles should be searching for adequate aquatic habitats as long as temporary savannah waters are becoming inhospitable and are falling dry. Seven rock pools in the riverbed of the Como{\´e} River were artificially filled and thus offered for colonization at the peak of the dry season (end of January). After five days the rock pools were quantitatively sampled by completely emptying them. All the rock pools were colonized by Dytiscidae and / or Noteridae and with a total of 1,507 individuals in 26 species abundance and diversity were high. Habitats for aestivation are needed most, when the majority of the savannah waters are fallen dry. Little precipitation on February 18th 1999 had filled rock pools in the riverbed of the Como{\´e} River but no pools in the savannah, where the rain was immediately absorbed by the very dry soil. An inventory of beetles was performed in 21 naturally filled rock pools five to 20 days after this precipitation. The sampling yielded 8,456 individuals in 41 species. Except the smallest, all rock pools contained beetles. The result showed that Dytiscidae and Noteridae utilise the rock pools as aquatic habitat during dry season. Beetles adapted to a highly seasonal environment like the aquatic system in the study area should be good colonizers. Sampling of four, respectively five rock pools at two occasions within 24 hours after the start of precipitation examined the potential of colonizers at that period (March). Prior to these precipitations the pools had been completely dry. Dytiscidae were already present in all rock pools and a total of 434 Dytiscidae in 14 species was found. The working hypothesis of cyclic migration suggests that the beetles should leave the rock pools at the onset of the rainy season when precipitation had filled temporary water bodies in the savannah. After several precipitation events an inventory of 13 rock pools of the Como{\´e} River in May controlled for adult beetles. Only four species with 126 individuals were still found, of which Yolina chopardi contributed 81.7\%. This species seems to differ from the other recorded species in the use of habitats, since it was never recorded in the savannah. In general, however, diversity and abundance of Dytiscidae and Noteridae in the rock pools, as expected, was low after the onset of the rainy season. During the entire study of the rock pools in the riverbed of the Como{\´e} River 10,523 individuals in 44 species and 18 genera were collected. Thus, more than half of the species recorded in Como{\´e} National Park were found in the rock pools. The results suggest that the Como{\´e} River and the rock pools in the riverbed serve as aquatic retreat for adult Dytiscidae and Noteridae during dry season when temporary water bodies in the savannah are desiccated. The suggested cyclic migration between water bodies predicts that newly formed savannah waters are recolonized by the beetles at the onset of the rainy season. This colonization should be a) by adults and b) airborne. Two artificial ponds in the open savannah were offered only for aerial colonization at the beginning of the rainy season. The ponds were controlled for adult Noteridae and Dytiscidae daily during one continuous phase of eleven and a second one of 16 days (end of March to end of April). On every sampling date Noteridae or Dytiscidae were recorded. In the entire study 2,744 individuals in 44 species and 16 genera were collected. After precipitation, abundance and species richness increased. Thirty-five of the encountered species had been recorded in rock pools of the Como{\´e} River before. The principal species in the artificial savannah ponds had been principal species in samplings of the rock pools as well. The results support the hypothesis of cyclic migration: most species of Dytiscidae and Noteridae of the Como{\´e} National Park fly from desiccating savannah waters to permanent water bodies or water bodies holding water for extended times during dry season. They pass the dry season in these waters and fly back into the savannah after precipitation at the onset of the rainy season. Exceptions from this general rule are discussed.}, subject = {Schwimmk{\"a}fer}, language = {en} } @phdthesis{Luo2004, author = {Luo, Qin}, title = {Essential features of a PrfA-dependent : promoter of Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10341}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {The gram-positive, facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis. Most of well-known virulence genes are controlled by PrfA that belongs to the Crp-Fnr family of transcriptional activators. A PrfA-mediated transcription initiating at a virulence gene promoter, inlC promoter (PinlC) that regulates the expression of the small, secreted internalin C, was in-depth characterized by an in vitro transcription system to unravel the essential features of a PrfA-dependent promoter in this study. The obtained results indicate a dual promoter for inlC that leads to PrfA-dependent and -independent transcription in vitro and in vivo. The PrfA-dependent transcription requires, as expected, the PrfA-box, a conserved 14 bp sequence of dyad symmetry located about 40 bp upstream of the transcriptional start site of each PrfA-regulated gene. Another important structural feature for this PrfA-dependent promoter is the distance between the 3´-end of the PrfA-box and the 5´-end of the SigA-recognized -10 box fixed to 22 or 23 bp, which is observed in the interspace regions of the other known PrfA-dependent promoters, e.g. PactA, PplcA, Phly and Pmpl. The -35 box of PinlC is not necessary for PrfA-dependent transcription. The -10 box of PinlC and also that of the other PrfA-dependent promoters of L. monocytogenes closely resemble SigA-recognized -10 promoter sequences of the well-characterized gram-positive bacterium B. subtilis. Even the extended -10 motif (5´-TRTG-3´) considered to be a basic element for many SigA-recognized promoters in B. subtilis is present in PinlC. Primer extension studies reveal that both the PrfA-dependent and the independent promoter share the same -10 box. The PrfA-independent transcription of inlC depends on a -35 box located directly downstream of the PrfA-box, and the close proximity of the two sites inhibits strongly the transcription activity of the PrfA-independent promoter when the PrfA-RNA polymerase complex binds to the PrfA-box. Deletion of the PrfA-box results in PrfA-independent transcription from PinlC, which is no longer inhibited by PrfA. High concentration of GTP appears to be necessary for PrfA-dependent transcription initiated at the inlC promoter and at other PrfA-dependent promoters. Based on transcriptome analysis, Milohanic and his co-workers identified three groups of genes that were regulated differently by PrfA. Some of these genes containing putative PrfA-boxes in their 5´-upstream regulatory regions were selected for analysis of their transcriptional dependency on PrfA using again the in vitro transcription system. The data show that among these "PrfA-regulated" promoters tested, only the promoter of the hpt gene belonging to group I is clearly activated by PrfA. This promoter is also the only one that exhibited all essential features of a typical PrfA-dependent promoter as described above. In vitro transcription starting at most of the other promoters was neither positively nor negatively affected by PrfA. Transcription initiated at some of the promoters of group III genes (lmo0596 and lmo2067) is rather inefficient with SigA-loaded RNA polymerase, but is highly activated with RNA polymerase loaded with purified SigB. Addition of purified PrfA protein has no effect on the SigB-dependent transcription. These in vitro transcription results indicate that the in vivo observed PrfA effect on the expression of most of the new genes is either indirect or PrfA-mediated transcription of these genes requires - in contrast to the PrfA-dependent transcription of the known virulence genes (including hpt) - additional factors not present in the in vitro transcription assay. In addition to these new genes described by Milohanic, the promoters of two genes (lmo2420 and lmo2840) that contain putative PrfA-boxes with only a single mismatch in their upstream regulatory regions were analyzed in this study. However, transcription of none of these genes is regulated by PrfA, suggesting that these genes are either not truly regulated by PrfA or regulated by other global transcription activators that interact with PrfA by yet unknown mechanisms. By exchanging corresponding sequences between a functionally inactive promoter ParoAP2 and a typical PrfA-dependent promoter PplcA, it is found that PrfA-dependent in vitro transcription can be initiated from the hybrid promoter containing the putative PrfA-box and the SigA-recognized -10 box (TTTAAT) from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter, but it is inhibited strongly by the interspace sequence between these two sites apparently due to an additional RNA polymerase binding site [the -10 box (TAATAT) for the PrfA-independent transcription of ParoAP1)] within this region. Furthermore, a symmetric sequence downstream of the -10 box (TTTAAT) is also shown to be a strongly inhibitory for PrfA-dependent transcription from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {en} } @phdthesis{Gerlach2004, author = {Gerlach, Gabriele}, title = {Funktionelle Charakterisierung des BvgAS BH-Zwei-Komponentensystems von Bordetella holmesii}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10419}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Zur Gattung Bordetella geh{\"o}ren mehrere zum Teil sehr eng miteinander verwandte Keime, die bislang, mit Ausnahme des Umweltisolats B. petrii, ausschließlich in Assoziation mit einem Wirtsorganismus nachgewiesen werden konnten. Hierzu geh{\"o}ren zum einen die „klassischen" Arten, deren pathogenes Potential vom obligat humanpathogenen Erreger des Keuchhustens, B. pertussis, dem ebenfalls humanpathogenen Keim B. parapertussis bis hin zu B. bronchiseptica, dem Erreger von Atemwegserkrankungen in verschiedenen S{\"a}ugetieren, reicht. Zum anderen wurde dieser Gattung mit B. avium, B. hinzii, B. trematum, B. holmesii und B. petrii in den letzten Jahren „neue" Arten zugeordnet, die zum Teil humanpathogenes, zum Teil tierpathogenes Potential besitzen. Da die evolution{\"a}ren Beziehungen der „neuen" Bordetella-Arten innerhalb der Gattung Bordetella bislang noch wenig untersucht wurden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Verbreitung und Konservierung von bekannten Bordetella-Genen und IS-Elementen bei den „neuen" Bordetella-Arten untersucht. Aufgrund der vermehrten Hinweise auf ein humanpathogenes Potential von B. holmesii und seiner Assoziation mit einem dem Keuchhusten {\"a}hnlichen Krankheitsbild wurde der Schwerpunkt dieser Untersuchungen auf die Analyse der phylogenetischen Beziehungen zwischen B. holmesii und dem B. bronchiseptica-Cluster gelegt. W{\"a}hrend durch den Nachweis der bei dem B. bronchiseptica-Cluster vorkommenden IS-Elemente IS481 und IS1001 die durch die 16S rDNA-Sequenz ermittelte Position von B. holmesii innerhalb des B. bronchiseptica-Clusters best{\"a}tigt werden konnte, ergab eine vergleichende Sequenzanalyse der in der Gattung Bordetella hoch konservierten Proteine OmpA, BvgA und BvgS die interessante Beobachtung, dass dieser Organismus in dieser Hinsicht viel mehr {\"A}hnlichkeiten zu den „neuen" Bordetella-Arten besitzt und in diesem Zusammenhang phylogenetisch eher im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Bei der Charakterisierung von vier unterschiedlichen B. holmesii-Blutisolaten wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei variante B. holmesii-St{\"a}mme identifiziert, die sich hinsichtlich der fehlenden Expression des intakten Response-Regulators BvgABH von wildtypischen B. holmesii-Isolaten unterscheiden. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass bei diesen phasenvarianten St{\"a}mmen die fehlende Expression auf eine Punktmutation innerhalb der bvgABH-Nukleotidsequenz zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Diese wird in beiden F{\"a}llen an der selben Nukleotidposition durch die Insertion eines Adenosinrestes hervorgerufen. Obwohl dieser Sequenzabschnitt nicht durch eine repetitive Nukleotidfolge gekennzeichnet ist und somit keinerlei {\"A}hnlichkeiten mit einer f{\"u}r Frameshift-Mutationen anf{\"a}lligen Stelle besitzt, k{\"o}nnte es sich bei der identifizierten DNA-Region dennoch um einen „hot spot" f{\"u}r eine Punktmutation handeln, da die zwei varianten B. holmesii-St{\"a}mmen unabh{\"a}ngig voneinander aus unterschiedlichen Blutkulturen isoliert wurden. Von besonderer Bedeutung war zudem die Beobachtung, dass sich unter diesen varianten St{\"a}mmen auch der bei den Stammsammlungen als Referenzstamm abgelegte B. holmesii-Stamm ATCC51541 befindet. Da im Rahmen dieser Arbeit keinerlei offensichtliche ph{\"a}notypische Unterschiede zwischen den varianten und den wildtypischen B. holmesii-St{\"a}mmen festgestellt werden konnten, bleibt die Bedeutung der Phasenvariation bei B. holmesii bislang noch ungekl{\"a}rt. Im weiteren wurde mit Hilfe eines „Genome Walks" die an den bvgABH-Leserahmen angrenzenden DNA-Bereiche f{\"u}r B. holmesii ermittelt. Dabei konnte 5 bp nach dem bvgABH-Stoppcodon ein weiterer Leserahmen (bvgSBH) identifiziert werden, welcher Homologien zu der Histidinkinase BvgS aus B. pertussis besitzt. Interessanterweise stellte sich bei der Sequenzanalyse heraus, dass der Konservierungsgrad des bvgASBH-Locus aus B. holmesii und des bvgAS-Locus aus B. pertussis auf DNA-Ebene sehr gering ist. Diese Beobachtung erkl{\"a}rt wiederum, warum der bvgASBH-Genlocus aus B. holmesii fr{\"u}her nicht durch DNA/DNA- Hybridisierungs-Experimente mit einer B. pertussis spezifischen DNA-Sonde nachgewiesen werden konnte und sein Vorhandensein erst nach dem Einsatz von degenerierten Primern {\"u}ber PCR-Analysen detektiert werden konnte. Im weiteren konnte {\"u}ber den „Genome Walk" gezeigt werden, dass die an dem bvgAS-Locus angrenzenden DNA-Bereiche innerhalb der Gattung Bordetella nicht konserviert sind. Zum einen ist der bvgASBH-Locus aus B. holmesii nicht wie bei dem B. bronchiseptica-Cluster in 5´-Richtung von dem fhaB-orthologen Genlocus benachbart, da sich an dieser Stelle ein weiterer, potentieller Response-Regulator befindet. Ebenso konnten stromaufw{\"a}rts von bvgASBH keinerlei Hinweise auf das Vorhandensein eines, dem bvgR-Gen der „klassischen" Arten orthologen Leserahmens erzielt werden. {\"U}ber weitere Sequenzanalysen konnte dar{\"u}ber hinaus gezeigt werden, dass der Promotorbereich des bvgASBH-Genlocus {\"u}berraschenderweise keinerlei offensichtliche Sequenzhomologien zu dem entsprechenden Promotorbereich der bvgAup-Region der „klassischen" Arten zeigt. Dennoch konnten {\"u}ber in silico-Analysen mehrere Sequenzmotive innerhalb der bvgABHup-Region identifiziert werden, die als „inverted repeat"-Strukturen angeordnet sind und die zum Teil eine hohe {\"U}bereinstimmung zu der f{\"u}r die „klassischen" Bordetella-Arten beschriebene BvgA-Konsensussequenz 5´-T/A T T C C/T T A-3 besitzen. W{\"a}hrend sich diese Wiederholungssequenzen hinsichtlich ihrer Symmetrie und ihrer Anordnung von denen innerhalb der f{\"u}r das B. bronchiseptica-Cluster beschriebenen bvgAup-Region unterscheiden, konnten auff{\"a}llige Parallelen zu der Promotorregion des vag- (virulence activated gene) Gens bvgR festgestellt werden. Obwohl sowohl der Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii als auch das BvgA-Protein aus B. pertussis in vitro an die „inverted repeat" Strukturen der bvgABHup-Region binden kann, f{\"u}hrte eine Analyse der GFP-Expression der Reportergenfusion bvgABHup-gfp zu der erstaunlichen Beobachtung, dass die Reportergenfusion in B. pertussis durch die Bindung des BvgA-Proteins reprimiert wird, w{\"a}hrend sie im Gegensatz dazu in B. holmesii durch die Bindung des BvgABH-Proteins aktiviert wird. Die molekulare Grundlage f{\"u}r diese unterschiedlichen Regulationsmechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Trotz einer umfangreichen Sequenzkonservierung zwischen dem Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii und BvgA aus B. pertussis ist das BvgABH-Protein nicht in Lage, die Funktion des BvgA-Proteins aus B. pertussis in vitro bzw. in vivo zu ersetzen. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe von Komplementationsexperimenten gezeigt werden, dass die Histidinkinase BvgSBH aus B. holmesii in der Lage ist, die Funktion des in dem B. pertussis Stamm 347 mutierten BvgS-Proteins zu {\"u}bernehmen. {\"U}berraschenderweise unterschiedet sich jedoch das BvgSBH-Protein hinsichtlich der Wahrnehmung der Umweltstimuli von BvgS, da die Aktivit{\"a}t der Histidinkinase BvgSBH in dem hybriden B. pertussis Stamm BP 347 (pRK415-bvgASBH ATCC51541) nicht vollst{\"a}ndig durch Sulfationen moduliert werden kann. Dies ist m{\"o}glicherweise darauf zur{\"u}ckzuf{\"u}hren, dass im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Regionen die BvgSBH- und BvgS- Sensorproteine vor allem in ihren sensorischen Bereichen einen sehr geringen Konservierungsgrad aufweisen.}, subject = {Bordetella}, language = {de} } @phdthesis{Hassel2003, author = {Hassel, Jessica C.}, title = {Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {{\"U}berexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus f{\"u}hrt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung f{\"u}hrt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden k{\"o}nnen, scheinen somit {\"u}ber entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion verf{\"u}gen zu m{\"u}ssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu geh{\"o}ren die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk, deren extrazellul{\"a}rer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellul{\"a}rer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abh{\"a}ngigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen f{\"u}hrt zu IL-3 unabh{\"a}ngigem Wachstum und zu Langzeit{\"u}berleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeit{\"u}berleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeit{\"u}berleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer h{\"o}heren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verk{\"u}rzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß f{\"u}r die Ausl{\"o}sung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, w{\"a}hrend f{\"u}r eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und f{\"u}r Langzeit{\"u}berleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf f{\"u}r die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine f{\"u}hrt, w{\"a}hrend der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß f{\"u}r die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber m{\"o}glicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verst{\"a}rken. F{\"u}r die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das f{\"u}r ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schw{\"a}chere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, w{\"a}hrend der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 f{\"u}hren. Da diese Mutante kein Langzeit{\"u}berleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend f{\"u}r Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeit{\"u}berleben zu sichern. Expression der Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk in murinen Melanozyten f{\"u}hrt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivit{\"a}t von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, w{\"a}hrend STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivit{\"a}t aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein {\"a}hnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen f{\"u}hrt (Wellbrock, unver{\"o}ffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend f{\"u}r die Antiapoptose von Melanomen zu sein.}, language = {de} } @phdthesis{Schwaerzel2003, author = {Schw{\"a}rzel, Martin}, title = {Localizing engrams of olfactory memories in Drosophila}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5065}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Zars and co-workers were able to localize an engram of aversive olfactory memory to the mushroom bodies of Drosophila (Zars et al., 2000). In this thesis, I followed up on this finding in two ways. Inspired by Zars et al. (2000), I first focused on the whether it would also be possible to localize memory extinction.While memory extinction is well established behaviorally, little is known about the underlying circuitry and molecular mechanisms. In extension to the findings by Zars et al (2000), I show that aversive olfactory memories remain localized to a subset of mushroom body Kenyon cells for up to 3 hours. Extinction localizes to the same set of Kenyon cells. This common localization suggests a model in which unreinforced presentations of a previously learned odorant intracellularly antagonizes the signaling cascades underlying memory formation. The second part also targets memory localization, but addresses appetitive memory. I show that memories for the same olfactory cue can be established through either sugar or electric shock reinforcement. Importantly, these memories localize to the same set of neurons within the mushroom body. Thus, the question becomes apparent how the same signal can be associated with different events. It is shown that two different monoamines are specificaly necessary for formation of either of these memories, dopamine in case of electric shock and octopamine in case of sugar memory, respectively. Taking the representation of the olfactory cue within the mushroom bodies into account, the data suggest that the two memory traces are located in the same Kenyon cells, but in separate subcellular domains, one modulated by dopamine, the other by octopamine. Taken together, this study takes two further steps in the search for the engram. (1) The result that in Drosophila olfactory learning several memories are organized within the same set of Kenyon cells is in contrast to the pessimism expressed by Lashley that is might not be possible to localize an engram. (2) Beyond localization, a possibible mechanism how several engrams about the same stimulus can be localized within the same neurons might be suggested by the models of subcellular organisation, as postulated in case of appetitive and aversive memory on the one hand and acquisition and extinction of aversive memory on the other hand.}, subject = {Taufliege}, language = {en} } @phdthesis{Gehrig2003, author = {Gehrig, Andrea}, title = {Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Heredit{\"a}re Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auff{\"a}llig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufkl{\"a}rung der genetischen Ursachen einiger ausgew{\"a}hlter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgekl{\"a}rt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte f{\"u}r 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine h{\"a}ufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge M{\"a}nner weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Ver{\"a}nderungen der zentralen Retina f{\"u}hren. Ungef{\"a}hr 50 \% der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit {\"o}ffentlich zug{\"a}nglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert f{\"u}r ein putatives 224 Aminos{\"a}uren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindom{\"a}nen-Motiv enth{\"a}lt. Discoidindom{\"a}nen sind in Zelladh{\"a}sion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten best{\"a}tigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die {\"u}ber Disulfidbr{\"u}cken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfl{\"a}che der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der {\"a}ußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell f{\"u}r die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren f{\"u}hren. Gegenw{\"a}rtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgef{\"u}hrt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß dar{\"u}ber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein m{\"o}glicher Therapieansatz f{\"u}r RS auch beim Menschen sein k{\"o}nnte.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Wagner2003, author = {Wagner, Nicole}, title = {Charakterisierung der Kernmembranproteine Lamin-B-Rezeptor und Bocksbeutel von Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7245}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Dom{\"a}nen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Nedvetsky2003, author = {Nedvetsky, Pavel I.}, title = {Regulation of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7046}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier.}, subject = {Guanylatcyclase}, language = {en} }