@phdthesis{Juergens2016,
  author    = {J{\"u}rgens, Constantin Johannes Sebastian},
  title     = {Untersuchungen zum antiproliferativen Potential von Stoffwechselinhibitoren bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-140061},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Das Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob der Stoffwechsel kolorektaler Karzi-nomzellen geeignete Targetstrukturen f{\"u}r m{\"o}gliche therapeutische Ans{\"a}tze aufweist. In Krebszellen induziert sowohl der Warburg-Effekt bei Normoxie als auch die anaerobe Glykolyse bei Hypoxie eine massive Bildung von Laktat. Wird die Krebszelle dauerhaft daran gehindert, die f{\"u}r die Glykolyse notwendi-gen Reduktions{\"a}quivalente NADH+H+ mit Hilfe der Laktatdehydrogenase zu reoxidieren und/oder Laktat {\"u}ber die Transporter MCT1 und MCT4 nach außen zu schleusen, dann l{\"o}st diese Kombination aus Mangelsituation und intrazellul{\"a}rer Ans{\"a}uerung den apoptotischen Zelltod aus. F{\"u}r die Situation in vivo ist entscheidend, dass auch Zellen von Normalgeweben zwar Laktat in Hypoxie bilden, dies jedoch keine vorherrschende physiologische Situation darstellt. Die Hemmstoffe Natriumoxamat (NaOx) f{\"u}r die Laktatdehydrogenase und α-Cyano-4-Hydroxycinnamat (αCHC) f{\"u}r MCT1 und MCT4 wurden an den sechs humanen kolorektalen Karzinomzelllinien Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 und WiDr untersucht. Zus{\"a}tzlich wurde der Glukoseverbrauch und die Laktatbildung bestimmt und die Funktion der Atmungskette {\"u}berpr{\"u}ft. Die IC50-Werte f{\"u}r 5-FU, NaOx und αCHC wurden bestimmt und danach NaOx in einer Konzentration von 40x10-3 mol/L, αCHC in einer Konzentration von 2x10-3 mol/L und 5-FU in einer Konzentration von 5x10-6 mol/L eingesetzt. Die Zellen wurden bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 \% und 1 \% Sauerstoff f{\"u}r bis zu 120 Stunden inkubiert. Die Funktion der Atmungskette in den Mitochondrien der kolorektalen Karzi-nomzellen wurde u. a. durch Bestimmung wichtiger Kenngr{\"o}ßen wie dem P:O Quotienten und des respiratorischen Kontrollindex (RKI) nachgewiesen. F{\"u}nf der sechs Karzinomzelllinien wiesen im Vergleich zur Kontrollzelllinie J774 einen verringerten P:O-Quotienten und respiratorischen Kontrollindex (RKI) auf, was darauf hindeutet, dass die Funktion der Mitochondrien dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zwar verringert war, aber nicht vollst{\"a}ndig aufgehoben. Dieses Ergebnis st{\"u}tzt die allgemein akzeptierte Auffassung, dass die meisten Tumore {\"u}ber funktionelle Mitochondrien verf{\"u}gen. Durch die Analyse des Glukosestoffwechsels wurden die sechs kolorektalen Zelllinien, die einen unterschiedlich stark ausgepr{\"a}gten glykolytischen Ph{\"a}notyp aufwiesen, nach der St{\"a}rke der Laktatbildung bei 5 \% Sauerstoff in drei Kategorien eingeordnet. Zudem wurde f{\"u}r jede der sechs Zelllinien die Expression von LDH-A, LDH-B sowie MCT-1 und MCT-4 auf Proteinebene nachgewiesen. Wesentliches Ziel der Untersuchungen war die {\"U}berpr{\"u}fung des antiprolife-rativen Potentials der beiden Inhibitoren NaOx und αCHC einzeln oder in Kombination mit 5-FU bei den tumorspezifischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 \% und 1 \%. Die Kombination aus NaOx und αCHC induzierte bei 1 \% Sauerstoff nach 9 Tagen in Kultur zytotoxische Effekte und war damit so wirksam wie 5x10-6 mol/L 5-FU. Die Zugabe von 5-FU zur Kombination aus NaOx und αCHC f{\"u}hrte zu keiner Steigerung des zelltoxischen Effektes. Die beiden Inhibitoren NaOx und αCHC waren f{\"u}r SW620 Zellen weniger wirksam als f{\"u}r Zellen der anderen f{\"u}nf Zelllinien. Das mehr „oxidative" Profil von SW620 Zellen (bester P:O-Quotient, geringste Laktatbildung bei 5 \% und 1 \% Sauerstoff; zudem die h{\"o}chsten IC50-Werte f{\"u}r NaOx und αCHC) k{\"o}nnte erkl{\"a}ren, warum die beiden Stoffwechselinhibitoren, die einen glykolytischen Ph{\"a}notyp (starke Bildung von Laktat) erfordern, f{\"u}r SW620 Zellen von geringerer Wirksamkeit waren. F{\"u}r die Hemmstoffe NaOx und αCHC wurden zytostatische bzw. zytotoxische Effekte in kolorektalen Karzinomzellen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Krebszellen auf einen ungehinderten glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind. F{\"u}r beide Hemmstoffe wurde ebenfalls gezeigt, dass sie auch bei tumorre-levanten Sauerstoffkonzentrationen von 5 \% und 1 \% wirksam sind.},
  subject      = {Tumorzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kuger2015,
  author    = {Kuger, Sebastian},
  title     = {Radiosensibilisierung humaner Tumorzelllinien unterschiedlicher Entit{\"a}ten durch den dualen PI3K/mTOR-Inhibitor NVP-BEZ235 alleine oder in Kombination mit dem MEK-Inhibitor AZD6244: Einfluss des Behandlungsschemas und der Hypoxie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-126715},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Eine wichtige Standardtherapie in der modernen Behandlung von Krebserkrankungen ist die Strahlentherapie, in welcher Tumorzellen mittels ionisierender Strahlung gesch{\"a}digt und abget{\"o}tet werden. Dabei soll die Sch{\"a}digung des umgebenden Normalgewebes m{\"o}glichst gering gehalten und trotzdem eine maximale Sch{\"a}digung des Tumorgewebes erreicht werden. Deshalb sind neue Strategien zur Steigerung der Radiosensitivit{\"a}t des Tumorgewebes sehr wichtig, die es erlauben, bei gleicher Dosis eine verst{\"a}rkte Strahlenantwort im Tumorgewebe zu erreichen. Hier kommen zunehmend sog. Radiosensibilisatoren zum Einsatz, die unter anderem onkogene Signalwege in den Tumorzellen inhibieren. Der PI3K/Akt/mTOR Signalweg stellt hierbei einen wichtigen Ansatzpunkt dar, da er in vielen Tumorentit{\"a}ten dereguliert vorliegt und diese Signalkaskade bekanntermaßen einen Einfluss auf die zellul{\"a}re Strahlensensitivit{\"a}t hat. Obwohl es f{\"u}r diesen Signalweg schon eine Reihe von Inhibitoren gibt, f{\"u}r die bereits neben einer anti-proliferativen Wirkung auch ein radiosensibilisierender Effekt nachgewiesen wurde (z.B. Wortmannin und Rapamycin), machten eine geringe Spezifit{\"a}t, starke Nebenwirkungen und negative R{\"u}ckkopplungsmechanismen im Signalweg, die die Wirkung des Inhibitors kompensieren, die Entwicklung neuer Inhibitoren notwendig. Das Imidazoquinolinderivat NVP-BEZ235 inhibiert den PI3K/Akt/mTOR Signalweg an mehreren Stellen gleichzeitig, indem es kompetitiv zu ATP das katalytische Zentrum von PI3K und mTOR blockiert. F{\"u}r diesen kleinmolekularen, dualen Inhibitor gibt es bereits erste vielversprechende Forschungsergebnisse hinsichtlich einer radiosensibilisierenden Wirkung, allerdings sind die zugrunde liegenden molekularbiologischen Mechanismen noch nicht vollst{\"a}ndig gekl{\"a}rt. Deshalb war das Ziel der vorliegenden Dissertation, in drei Teilprojekten mehrere Aspekte der NVP-BEZ235-induzierten Radiosensibilisierung aufzukl{\"a}ren: a) Einfluss des Behandlungsschemas f{\"u}r NVP-BEZ235 in vier Glioblastomzelllinien mit unterschiedlichem PTEN und TP53 Mutationsstatus, b) Einfluss der Sauerstoffversorgung (Hypoxie, Normoxie, reoxygeniert nach Bestrahlung) auf die strahlensensibilisierende Wirkung von NVP-BEZ235 in zwei Mammakarzinomzelllinien, c) gleichzeitige Inhibierung des MAPK Signalwegs durch AZD6244 und der PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade durch NVP-BEZ235 in zwei Zelllinien mit unter-schiedlichem Mutationsstatus aus verschiedenen Tumorentit{\"a}ten, um synergistische Effekte zu untersuchen. Um diese Fragestellungen zu beantworten, wurde im Rahmen - 142 - der Dissertation eine Auswahl an humanen Tumorzelllinien mit unterschiedlich deregulierten Signalwegen bearbeitet. Dabei wurde die Expression von Schl{\"u}sselproteinen der MAPK/Erk und der PI3K/Akt/mTOR Signalwege analysiert und mit zellbiologischen Daten verschiedener ph{\"a}notypischer Endpunkte nach Inhibitor Behandlung und Bestrahlung integriert (Proliferationsrate, klonogenes {\"U}berleben, Zellzyklusaberrationen, DNS-Sch{\"a}den und -Reparatur, Zelltod und Autophagie). Im Teilprojekt zum Behandlungsschema der NVP-BEZ235 Inhibierung und Bestrahlung konnte in vier Glioblastomzelllinien mit Behandlungsschema I (NVP-BEZ235 Behandlung 24 Stunden vor Bestrahlung) kein radiosensibilisierender Effekt hinsichtlich klonogenem {\"U}berleben nachgewiesen werden, wohingegen Behandlungsschema II (NVP-BEZ235 Behandlung 1 h vor und im Anschluss an die Bestrahlung) unabh{\"a}ngig vom Mutationsstatus in allen vier Zelllinien eine starke Radiosensibilisierung bewirkte. Auf molekularer Ebene war zwischen beiden Behandlungsschemata f{\"u}r das antiapoptotische Protein Akt ein großer Unterschied zu beobachten, welches bei Behandlung nach Schema I zum Zeitpunkt der Bestrahlung {\"u}beraktiviert, nach Behandlung mit Schema II hingegen inhibiert war. Weiterhin resultierte Behandlungsschema I in einem erh{\"o}hten Anteil der Zellen in der radioresistenteren G1-Phase des Zellzyklus zum Zeit-punkt der Bestrahlung. Behandlungsschema II f{\"u}hrte hingegen nach Bestrahlung zu einer verminderten Expression des Reparaturproteins Rad51 und damit zu verminderter DNS-Schadensreparatur und schließlich zu einem stabilen Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus sowie zu verst{\"a}rkter Apoptose (erh{\"o}hte Spaltung von PARP, erh{\"o}hter Anteil hypodiploider Zellen). Somit zeigen diese Ergebnisse, dass unabh{\"a}ngig vom PTEN und TP53 Mutationsstatus eine Radiosensibilisierung nur durch das Behandlungsschema II erreicht werden konnte. Ferner deuten die Ergebnisse der Proteinexpression darauf hin, dass durch NVP-BEZ235 ein negativer R{\"u}ckkopplungsmechanismus ausgel{\"o}st wird, wodurch die PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade 24h nach Zugabe des Inhibitors aktiviert und synergistische Effekte mit ionisierender Bestrahlung aufgehoben wurden. Im Teilprojekt zur Abh{\"a}ngigkeit der NVP-BEZ235 Inhibition vom Sauerstoffgehalt wurden in den beiden Brustkrebszelllinien MCF-7 (ER-positiv) und TN MDA-MB-231 (TP53 mutiert) normoxische, hypoxische und nach Bestrahlung reoxygenierte Kulturbedingungen im Hinblick auf die Koloniebildungsf{\"a}higkeit nach NVP-BEZ235 Behandlung und Bestrahlung untersucht. Die beobachtete Radiosensibilisierung war unter allen getesteten Bedingungen auf gleichem Niveau. In beiden Zelllinien bewirkte NVP-BEZ235 eine Inhibition des antiapoptotischen HIF-1α Proteins, eine stabile Inaktivierung des PI3K/Akt/mTOR Signalweges und eine Aktivierung der Autophagie. Nach Bestrahlung waren zudem erh{\"o}hte residuale DNS-Sch{\"a}den und ein stabiler Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus unter allen Oxygenierungsbedingungen in beiden Zelllinien zu beobachten. Eine Apoptose Induktion (Spaltung von PARP, hypodiploide Zellen) trat nur in der TP53 wildtypischen MCF-7 Zelllinie nach NVP-BEZ235 Behandlung auf. Somit konnte in beiden Zelllinien in allen pathophysiologisch relevanten Oxygenierungszust{\"a}nden eine sauerstoffunabh{\"a}ngige Radiosensibilisierung durch NVP-BEZ235 gezeigt werden. Der bisher nicht erforschte Aspekt zur synergistischen Wirkung des MEK Inhibitors AZD6244 und des dualen PI3K/Akt/mTOR Inhibitors NVP-BEZ235 nach Bestrahlung wurde an der Glioblastomzelllinie SNB19 und der Lungenkarzinomzelllinie A549 anhand der Koloniebildungsf{\"a}higkeit der behandelten Zellen untersucht. Eine Behandlung mit dem MEK Inhibitor bewirkte lediglich eine moderate Radiosensibilisierung, wohin-gegen der duale PI3K/Akt/mTOR Inhibitor beide Zelllinien in st{\"a}rkerem Maße sensibilisierte. Eine Kombination beider Inhibitoren resultierte bei keiner Zelllinie in einer Verst{\"a}rkung der durch NVP-BEZ235 induzierten Radiosensibilisierung. Eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r die fehlende Synergie im Bezug auf die Radiosensibilisierung k{\"o}nnen die gegens{\"a}tzlichen Effekte der beiden Inhibitoren auf den Zellzyklus sein. Auf Proteinebene f{\"u}hrte eine simultane Behandlung mit beiden Substanzen zur Inhibition beider Signalwege. Dar{\"u}ber hinaus war in SNB19 Zellen eine verst{\"a}rkte Dephosphorylierung von Rb und ein erh{\"o}hter Anteil an G1-Phase Zellen bei kombinierter Gabe der Inhibitoren zu beobachten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit die radiosensibilisierende Wirkung von NVP-BEZ235 in Abh{\"a}ngigkeit vom Behandlungsschema gezeigt werden. Ferner wurde nachgewiesen, dass die Radiosensibilisierung unabh{\"a}ngig von der Sauerstoffversorgung sowie von den PTEN und TP53 Mutationsstatus der Tumorzellen ist. Die kombinierte Inhibition der MAPK und PI3K/Akt/mTOR Signalwege resultierte zwar in einem verst{\"a}rkten zytostatischen, aber nicht in einem verst{\"a}rkten radiosensibilisierenden Effekt. Da allerdings eine große Anzahl verschiedener Inhibitoren der MAPK/Erk und der PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade verf{\"u}gbar sind, sollte die kombinatorische Inhibition dieser Signalwege systematisch weiter verfolgt werden. Die vorliegende Arbeit liefert auch weitere grundlegende Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen der Radiosensibilisierung durch NVP-BEZ235, die auch auf Verkn{\"u}pfungen und Wechselwirkungen mit anderen als den bisher bekannten Proteinen hindeuten, die f{\"u}r jeden Inhibitor aufgekl{\"a}rt werden m{\"u}ssen, um eine effektive radiosensibilisierende Wirkung vorher-sagen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Strahlensensibilisator},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Walz2014,
  author    = {Walz, Susanne},
  title     = {DNA-Bindung von Myc und Miz1 und transkriptionelle Regulation ihrer Zielgene},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106249},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein charakteristisches Merkmal f{\"u}r eine Vielzahl von humanen Tumoren. Durch die transkriptionelle Aktivierung von Genen, die im Zusammenhang mit Metabolismus, Translation und Proliferation stehen, wird dadurch das Tumorwachstum beg{\"u}nstigt. Myc bildet zudem mit dem Zinkfinger-Protein Miz1 einen Komplex, der hemmend auf die Transkription von Zielgenen wirkt. Bisher sind nur wenige Myc/Miz1-reprimierte Zielgene bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten genomweit die DNA-Bindestellen von Myc und Miz1 durch Chromatin-Immunpr{\"a}zipitationen gefolgt von Hochdurchsatzsequenzierung in einer Zervixkarzinomzelllinie bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Myc an Promotoren aller drei RNA-Polymerasen sowie in enhancer-Regionen bindet, w{\"a}hrend Miz1 Kernpromotoren von RNA-Polymerase II- und III-transkribierten Genen besetzt. reChIP-Experimente zeigten, dass Myc und Miz1 als Komplex an Promotoren von Zielgenen binden. Zudem wurde ein Miz1-DNA-Bindemotiv identifiziert und der transaktivierende Einfluss von Miz1 auf Gene mit diesem Motiv nachgewiesen. Das {\"u}berwiegende Vorhandensein von Myc/Max-Komplexen f{\"u}hrt zu einer Transaktivierung von E-Box-haltigen Promotoren. Andererseits erfolgt die transkriptionelle Repression von Myc/Miz1-Zielgenen an Promotoren, an denen der Myc/Miz1-Komplex vorherrscht. In aktuellen Publikationen konnte gezeigt werden, dass nach mitogener Stimulation von Lymphozyten es zu einer Erh{\"o}hung der Myc-Expression kommt, wodurch Myc als ein genereller Transkriptionsaktivator fungiert, der alle Gene gleichermaßen induziert. Trotz hoher Myc-Mengen in Tumorzellen konnte die generelle Myc-vermittelte Transaktivierung nicht nachgewiesen werden. Zus{\"a}tzlich zur Myc-abh{\"a}ngigen Transaktivierung von E-Box-haltigen Genen, z. B. beteiligt an Translation und RNA-Prozessierung, und der Miz1-vermittelten transkriptionellen Aktivierung von Genen mit Miz1-Motiv (z. B. involviert in Autophagie), konnte entgegen dem Modell der generellen Genamplifikation durch Myc eine Myc/Miz1-abh{\"a}ngige Repression von Zielgenen belegt werden. Die neu gewonnenen Erkenntnisse des Bindeverhaltens des Myc/Miz1-Komplexes und der daraus resultierenden transkriptionellen Regulation von Myc/Miz1-Zielgenen erm{\"o}glichen ein besseres Verst{\"a}ndnis der Myc-Funktion in Tumorzellen und k{\"o}nnte zur Verbesserung von Tumortherapien f{\"u}hren.},
  subject      = {Myc},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mihlan2012,
  author    = {Mihlan, Sabrina [geb. Jasper]},
  title     = {Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufkl{\"a}rung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {LASP-1 (LIM und SH3 Dom{\"a}nen Protein) ist ein in Zellen ubiquit{\"a}r vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische {\"U}berexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Dom{\"a}ne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Dom{\"a}ne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranforts{\"a}tzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. F{\"u}r Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Ger{\"u}stprotein und ist wichtig f{\"u}r die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erh{\"o}hte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensit{\"a}t mit der Tumorgr{\"o}ße sowie dem Langzeit{\"u}berleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zus{\"a}tzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentit{\"a}ten f{\"u}hrt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgekl{\"a}rt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpr{\"a}zipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion best{\"a}tigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abh{\"a}ngigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Abl{\"o}sung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies l{\"a}sst sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell f{\"u}r die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Dom{\"a}ne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminos{\"a}uren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei {\"u}ber das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt {\"u}ber das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erh{\"o}ht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminos{\"a}uresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zur{\"u}ck an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.},
  subject      = {Tumorzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Pfetzer2011,
  author    = {Pfetzer, Nadja},
  title     = {Identifizierung und Testung spezifischer Inhibitoren des Energiestoffwechsels von Tumorzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65406},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Charakteristisch f{\"u}r viele maligne Tumorzellen ist eine erh{\"o}hte Aufnahme von Glucose und die Bildung großer Mengen Milchs{\"a}ure auch in Anwesenheit von Sauerstoff (Warburg Effekt) und eine verminderte Nutzung des Zitratzyklus. Als Grund werden Defekte in der mitochondrialen Atmungskette diskutiert. Aber auch eine durch Onkogene gesteigerte Glykolyserate, k{\"o}nnte urs{\"a}chlich sein. Ein weiterer f{\"u}r Tumorzellen wichtiger Stoffwechselweg, in dem Glucose abgebaut wird, ist der Pentosephosphatweg, dessen Blockade das Wachstum der Krebszellen hemmen k{\"o}nnte. Zudem stellt die Manipulation derjenigen Signalwege, die in den Tumorstoffwechsel involviert und in Tumorzellen {\"u}beraktiviert (Ras/PI3K/Akt/mTOR- und Raf/MEK/ERK-Signalweg) oder unterdr{\"u}ckt (oxidative Phosphorylierung) sind, m{\"o}gliche Ansatzpunkte dar. In dieser Arbeit wurde daher in vitro die Wirkung von 15 Substanzen an drei verschiedenen Tumorzelllinien und vier verschiedenen benignen Zellen untersucht, welche in die oben genannten charakteristischen Stoffwechselwege von Tumorzellen eingreifen und gegenw{\"a}rtig intensiv als m{\"o}gliche Tumortherapeutika diskutiert werden. Ziel war es, geeignete Kandidaten f{\"u}r eine zielgerichtete Therapie zu identifizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Beeinflussung des Glucosestoffwechsels in Tumorzellen. Da Glucose sowohl aerob als auch anaerob verstoffwechselt werden kann, wurden in einem ersten Ansatz zum einen Substanzen gestestet, die die Glykolyse auf verschiedenen Ebenen hemmen, zum anderen wurden Substanzen untersucht, die den mitochondrialen Stoffwechsel beeinflussen. Die Wirkung aller 15 Substanzen wurde zun{\"a}chst jeweils als Einzelbehandlung getestet. Hierbei f{\"u}hrten nur sehr hohe Konzentrationen in Tumorzellen zu einem drastisch verminderten ATP-Gehalt, die f{\"u}r benigne Zellen aber ebenfalls toxisch waren. Daher wurde in einem zweiten Schritt untersucht, ob durch die gleichzeitige Manipulation des Glucosestoffwechsels und des mitochondrialen Stoffwechsels mit jeweils subtoxischen Konzentrationen eine tumorselektive Wirkung erreicht werden kann. Bei der Kombination der Substanzen Oxythiamin/NaDCA bzw. 2-DG/Rotenon ergaben sich zwar synergistische Effekte auf die Verminderung des ATP-Gehaltes in den getesteten Tumorzellen, eine generelle tumorselektive Wirkung konnte jedoch durch die kombinierte Behandlung nicht erreicht werden. In j{\"u}ngster Zeit mehren sich die Hinweise, dass die Glutaminolyse einen sehr wichtigen Stoffwechselweg f{\"u}r Energiegewinnung und Syntheseprozesse von Tumorzellen darstellt. Deshalb wurde in einem dritten Schritt untersucht, ob durch die Hemmung der Glutaminolyse mit der Substanz 6-Diazo-5-oxo-L-norleuzin (DON) eine tumorspezifische Wirkung erreicht werden kann. In der Tat konnte durch DON eine andeutungsweise tumorselektive Wirkung auf den ATP-Gehalt der Zellen erzielt werden, jedoch war das therapeutische Fenster sehr eng. Durch die Hemmung der oxidativen Phosphorylierung wurde in allen drei untersuchten Tumorzelllinien eine gesteigerte Milchs{\"a}ureproduktion nachgewiesen. Dies ist ein eindeutiger Hinweis daf{\"u}r, dass in diesen Tumorzellen die Mitochondrien keine Defekte aufweisen. Die hier untersuchten benignen und malignen Zellen wurden hinsichtlich des Glucosestoffwechsels mit verschiedenen Methoden n{\"a}her charakterisiert, um zu beurteilen, ob sich die Zellen in ihrem Stoffwechselph{\"a}notyp unterscheiden. Bei der Quantifizierung der Glucoseaufnahme wurde deutlich, dass auch manche benigne Zellen deutliche Mengen an Glucose aufnehmen, welche allerdings nur der Tumorzelllinie mit der niedrigsten Aufnahme glich. Mittels immunhistochemischer F{\"a}rbungen wurden charakteristische Proteine des Zuckerstoffwechsels dargestellt. Zudem wurde die Expression von zentralen Genen des Stoffwechsels auf mRNA- bzw. Proteinebene untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass sowohl Tumorzellen als auch manche benigne Zellen f{\"u}r die Glykolyse typische Proteine bzw. mRNA stark exprimieren. Fazit der Charakterisierung ist, dass es zwischen den hier verwendeten malignen und benignen Zellen keine eindeutige Differenzierung aufgrund des Stoffwechselprofils gibt, sondern sich die getesteten Zellen nur graduell unterscheiden. Dieses Ergebnis erkl{\"a}rt m{\"o}glicherweise die geringe Tumorspezifit{\"a}t der getesteten Substanzen. Im Vergleich mit den vielversprechenden Ergebnissen aus der Literatur zeigten die hier gewonnenen in vitro-Daten eindeutig, dass die Wirkung von potenziell tumorhemmenden Substanzen je nach Tumorzelltyp extrem verschieden war. Dies beruht darauf, dass der vorherrschende Stoffwechseltyp (oxidativ bzw. glykolytisch) f{\"u}r jede Tumorentit{\"a}t verschieden ist. Daher muss vermutlich f{\"u}r jede Tumorentit{\"a}t bzw. sogar f{\"u}r jeden Patienten individuell die Wirkung und der Nutzen einer Hemmung des Tumorstoffwechsels untersucht werden, bevor k{\"u}nftig an eine zielgerichtete Therapie gedacht werden kann.},
  subject      = {Tumorzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Daryab2009,
  author    = {Daryab, Neda},
  title     = {Plastizit{\"a}t der Tumorinvasion: Zellul{\"a}re und molekulare Mechanismen der Beta1-Integrin unabh{\"a}ngigen Migration von Melanomzellen und murinen embryonalen Fibroblasten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37343},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Die Migration von Tumorzellen im Bindegewebe erfordert adh{\"a}sive Zell-Matrix-Interaktionen, die durch Integrine und andere Adh{\"a}sionsmolek{\"u}le auf der Zelloberfl{\"a}che vermittelt werden. In 3DKollagenmatrices ben{\"o}tigen hochinvasive MV3-Melanomzellen {\"u}berwiegend \&\#945;2\&\#946;1-Integrine zur Elongation, Adh{\"a}sion an den Kollagenfasern und zur Faserb{\"u}ndelung, sowie zur Kraftgenerierung und Migration. Wir haben untersucht, ob die Migration von Tumorzellen in 3D-Kollagenmatrices vollst{\"a}ndig durch die Blockade der Integrinfunktion inhibierbar ist, oder ob es kompensatorische Mechanismen gibt, die zur Migration beitragen. Die \&\#946;1-Integrinfunktion wurde durch verschiedene Methoden reduziert: a) durchflusszytometrische Sortierung der Zellen in Subgruppen mit niedriger und hoher \&\#946;1-Integrin-Oberfl{\"a}chenexpression; b) Adh{\"a}sionsblockade mit monoklonalem anti \&\#946;1-Antik{\"o}rper 4B4 oder Rhodocetin, einem selektiven \&\#945;2\&\#946;1-Integrininantagonist; und c) Expression von dominant-negativen Peptiden zur Blockade der Funktion der \&\#946;1-Integrin-zytoplasmatischen Dom{\"a}ne. Alle \&\#946;1-Integrin-Interferenzstrategien induzierten einen {\"U}bergang der konstitutiv vorhandenen mesenchymalen Migration in einen neuen, am{\"o}boiden Migrationstyp (Mesenchymal-Amoeboid Transition, MAT), {\"a}hnlich der Migrationsweise von Monozyten oder Lymphozyten. Der {\"U}bergang zu am{\"o}boider Migration ging einher mit dem Verlust der zellvermittelten Kollagenkontraktion und -reorganisation. Subtotale Inhibition der Integrinfunktion (ca. 50\%) durch Antik{\"o}rper 4B4 ergab eine schnelle (0,3-0,4 >m/min) am{\"o}boide Migration, w{\"a}hrend 90-95\%ige Abs{\"a}ttigung des \&\#946;1-Integrin- Epitops zu langsamer am{\"o}boider Migration (0,03-0,2 >m/min) f{\"u}hrte. Induzierte am{\"o}boide Migration verursachte eine gleichm{\"a}ßige Verteilung der \&\#946;1-Integrine auf der Zelloberfl{\"a}che, ein diffuses kortikales Aktin-Zytoskelett, und war mit einer ausgepr{\"a}gten Formanpassung der Zelle an die Matrixstrukturen verbunden, die von kleinen Filopodien oder Oberfl{\"a}chenblebs getragen wurde. Die Befunde wurden f{\"u}r \&\#946;1-Integrin-defiziente murine embryonale Fibroblasten (MEF) und murine embryonale Stammzellen (GD25) best{\"a}tigt. \&\#946;1-Integrin-defiziente Fibroblasten zeigten eine schnelle, und GD25 ES-Zellen eine langsame am{\"o}boide Migration. Somit erfolgte die am{\"o}boide Migration ohne \&\#946;1-Integrin-vermittelte Zell-Matrix-Interaktionen. Weil keine vollst{\"a}ndige Immobilisierung der Zellen erzielt wurde, haben wir alternative Mechanismen von Zell-Matrix-Interaktionen untersucht, die zur Restaktivit{\"a}t der am{\"o}boiden Migration beitragen. Als potentielle Kandidaten wurden \&\#945;v-Integrine, die an denaturiertes Kollagen binden, und Oberfl{\"a}chen-Glycokonjugate getestet. Es wurden keine promigratorischen Funktionen RGDabh{\"a}ngiger Integrine (\&\#945;v oder \&\#946;3) mittels zyklischer Arginin-Glycin-Asparagins{\"a}ure (cRGD)beobachtet. Um herauszufinden, welche Rolle die Oberf{\"a}chen-Glycokalyx bei der Zellmigration spielen, wurden verschiedene Methoden angewandt: a) Die an die Proteine gebundenen Glycokonjugate wurden mit Hilfe von N- und O-Glycosidasen von der Oberfl{\"a}che der lebenden Zellen enzymatisch abgespalten; b) um die Sulfatierung der Glycokonjugate zu verhindern, wurden die Zellen in sulfatfreiem Medium kultiviert. Durch beide Methoden wurde die Bindung von Rutheniumrot an die Zelloberfl{\"a}che(Glycokalyx) um 60\% bzw. die von Heparansulfat der Zelloberfl{\"a}che um 60\% bis 100\% reduziert. Nicht die Desulfatierung f{\"u}hrte zur Abl{\"o}sung der Zellen vom Kulturflaschenboden, sondern allein dieBehandlung mit N- und O-Glycosidasen. Die gleichzeitige Behandlung von MV3 Melanomzellen mit N-, O- Glycosidase mit Inhibition der \&\#946;1-, \&\#945;v\&\#946;3-Integrine f{\"u}hrten zur Abrundung der Mehrzahl der Zellen, gefolgt von oszillierender Immobilit{\"a}t (‚Running on the spot') bzw. sehr langsamer Restmigration (<0,1 >m/min). Dagegen war die Migration der MV3-Zellen nach Kultivierung in sulfatfreiem Medium unver{\"a}ndert. Eine {\"a}hnliche Hemmung der Migration erfolgte in \&\#946;1-/- MEFs nach Glycanverdau. Folglich sind \&\#946;1-Integrine essentiell f{\"u}r fokalisierte Zell-Matrix-Interaktionen, f{\"u}r die mesenchymale Migration und den Matrixumbau, w{\"a}hrend am{\"o}boide Migration ohne Beteiligung von \&\#946;1-Integrinen erfolgt, aber durch niedrigaffine, diffuse Zell-Matrix-Interaktionen von Oberfl{\"a}chenglycanen vermittelt wird. Somit ist die Glycokalyx ein alternatives Adh{\"a}sionssystem f{\"u}r die integrinunabh{\"a}ngige Zellmigration.},
  subject      = {Melanomzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hayen2001,
  author    = {Hayen, Wiebke},
  title     = {Determinanten der Tumorzellmigration},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180784},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2001},
  abstract  = {Hyalurons{\"a}ure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellul{\"a}rmatrix vieler Gewebe und tritt in erh{\"o}hten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberfl{\"a}chenrezeptoren abh{\"a}ngt, sondern haupts{\"a}chlich von der Porosit{\"a}t der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antik{\"o}rper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Fl{\"u}ssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazellul{\"a}res Auftreten von HS vorwiegend perinukle{\"a}r mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Molek{\"u}le im Medium bestimmt werden.},
  subject      = {Tumorzelle},
  language  = {de}
}