@phdthesis{Saxena2011,
  author    = {Saxena, Ambrish},
  title     = {Role of the novel protein tyrosine phosphatase AUM for cell adhesion},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65503},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Cell adhesion and migration are essential for development and homeostasis. Adhesion to the extracellular matrix occurs at specialized plasma membrane domains where transmembrane adhesion receptors, signaling proteins such as kinases and phosphatases, and a large number of adaptor proteins interact with the cytoskeleton in a tightly regulated and synchronized fashion. Whereas altered cell adhesion and migration are known to be important in cardiovascular disease and malignant tumors, the target proteins and molecular interactions that regulate these complex processes still remain incompletely understood. Whereas numerous kinases are known to regulate cell adhesion dynamics, information about the involved protein phosphatases is still very limited. A newly emerging phosphatase family contains the unconventional active site sequence DXDX(T/V) and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases. Our laboratory has recently discovered AUM, a novel phosphatase that belongs to this poorly characterized enzyme family. Initial findings pointed toward a potential involvement of AUM in the regulation of cell adhesion to the extracellular matrix. The objective of the present study was to study the potential role of AUM in cell adhesion. We could show that cells stably depleted of AUM are characterized by accelerated adhesion on immobilized fibronectin. To confirm these findings, we used an siRNA-based approach for the acute depletion of AUM and observed a similar phenomenon. Rescue experiments were performed with stably AUM-depleted cells to ensure that the above mentioned effects are indeed AUM specific. We observed that the re-addition of AUM normalizes cellular adhesion kinetics on fibronectin. These results clearly show that AUM exerts important functions in cell-matrix adhesion. To investigate the molecular basis of these effects, we have characterized integrin expression patterns using flow cytometry. Interestingly, fibronectin-stimulated AUM-depleted cells are characterized by an increase in the cell surface expression of conformationally active 1-integrins. Consistent with the important role of 1-integrins in the regulation of RhoA activity, we also observed a specific increase in RhoA-GTP, but not Rac1-GTP-levels during cell adhesion to fibronectin. Consistent with these findings and with the important role of RhoA for focal adhesion maturation, AUM depleted cells showed more elongated and more centripetally oriented focal adhesions as compared to control cells when spread on fibronectin. Taken together, this study has revealed an important role of AUM for cell-matrix adhesion. Our findings strongly suggest that AUM functions as a negative regulator of 1-integrins and RhoA-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion.},
  subject      = {Proteintyrosinphosphatase},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Beer2011,
  author    = {Beer, Meike Vanessa},
  title     = {Correlation of ligand density with cell behavior on bioactive hydrogel layers},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74454},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Diese Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Quantifizierung von Zelladh{\"a}sion vermittelnden Liganden in und auf d{\"u}nnen Hydrogelschichten, die zur Oberfl{\"a}chenmodifizierung auf Biomaterialien aufgebracht wurden. Das bereits etablierte und gut charakterisierte inerte NCO-sP(EO-stat-PO) Hydrogelsystem, das eine einfache und reproduzierbare Bioaktivierung mit Peptiden erlaubt, wurde als Basis f{\"u}r diese Arbeit verwendet. Diese Hydrogele k{\"o}nnen auf zwei Weisen funktionalisiert werden. Liganden k{\"o}nnen entweder mit der Prepolymerl{\"o}sung vor der Beschichtung gemischt (Einmischmethode) oder frische Hydrogelschichten mit einer Ligandenl{\"o}sung inkubiert werden (Inkubationsmethode). Der erste Teil dieser in drei Hauptteile unterteilten Arbeit, besch{\"a}ftigte sich mit der Konzentrationsbestimmung der Liganden in der gesamten Tiefe der Hydrogelschicht, w{\"a}hrend sich der zweite Teil auf die oberfl{\"a}chensensitive Quantifizierung von Zelladh{\"a}sion vermittelnden Molek{\"u}len an der biologischen Grenzfl{\"a}che konzentrierte. Die Ergebnisse wurden mit Zelladh{\"a}sionskinetiken verglichen. Der dritte Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der biochemischen als auch strukturellen Nachahmung der komplexen Extrazellul{\"a}rmatrix (ECM). Das ECM Protein Fibronektin (FN) wurde {\"u}ber Zucker-Lektin Anbindung pr{\"a}sentiert und Zellverhalten auf diesen biomimetischen Oberfl{\"a}chen untersucht. Ebenfalls wurde Zellverhalten in einer dreidimensionalen Faserumgebung mit identischer Oberfl{\"a}chenchemie wie in den beiden ersten Teilen dieser Arbeit untersucht und mit der Peptidkonzentration korreliert. Insgesamt, war die Hauptfragestellung in dieser Arbeit 'Wie viel?', d.h. einerseits die Ermittlung der maximalen, als auch der f{\"u}r Zelladh{\"a}sion optimalen Ligandendichte. Im ersten praktischen Teil der vorliegenden Arbeit (Klassische Quantifizierung) wurden Liganden in der gesamten Hydrogelschicht, als auch speziell in oberen Bereichen der Schichten quantifiziert. Die Untersuchung der Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas funktionalisiert mit GRGDS und 125I-YRGDS erfolgte in Kapitel 3 mittels Radioaktivmessung. Wurden Hydrogelschichten mittels Inkubationsmethode funktionalisiert, konnte eine S{\"a}ttigung mit Liganden bei etwa 600 µg/mL ermittelt werden. Mittels Einmischmethode funktionalisierte Hydrogele erreichten keine maximale Ligandenkonzentration in den Schichten, mit dem Verh{\"a}ltnis 2/1 als maximales verwendetes Verh{\"a}ltnis. H{\"o}here Liganden zu Prepolymer Verh{\"a}ltnisse als 2/1 wurden jedoch nicht verwendet, um eine ausreichende Vernetzung der Hydrogele nicht zu gef{\"a}hrden. Zur Detektion mittels R{\"o}ntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Flugzeit-Sekund{\"a}rionen-Massen-spektrometrie (TOF-SIMS) (Kapitel 4) wurden eine fluorierte Aminos{\"a}ure und ein iodiertes Peptid mit den Prepolymeren in molaren Verh{\"a}ltnissen von 1/2, 1/1 und 2/1 gemischt. Beide Methoden ermittelten eine maximale Ligandenkonzentration bei Verh{\"a}ltnissen von 1/1. Zus{\"a}tzliche Liganden (2/1) f{\"u}hrten zu keiner vermehrten Anbindung. Wesentlich im Zusammenhang mit der Ligandenquantifizierung auf Biomaterialien ist, diese an der Oberfl{\"a}che, die f{\"u}r Zellen zug{\"a}nglich ist, durchzuf{\"u}hren. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Oberfl{\"a}chensensitive Quantifizierung) kamen daher Methoden zum Einsatz, die Liganden ausschließlich auf der Oberfl{\"a}che quantifizierten. Zur Detektion mit Oberfl{\"a}chenplasmon-resonanz (SPR) und akustischer Oberfl{\"a}chenwellentechnologie (SAW) in Kapitel 5 musste die Standardbeschichtung der Hydrogele von Glas und Silikon auf Cystamin funktionalisierte Goldoberfl{\"a}chen {\"u}bertragen werden. Mittels Ellipsometrie und Rasterkraftmikroskopie (AFM) konnte nur eine d{\"u}nne und inhomogene Hydrogelbeschichtung nachgewiesen werden. Dennoch zeigten SPR und SAW die Unterbindung von Serum und Streptavidin (SA) Adsorption auf nicht funktionalisierten Schichten, jedoch eine spezifische und konzentrationsabh{\"a}ngige SA Bindung auf Hydrogelschichten, die mit Biocytin und GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden. Die Ligandenquantifizierung mittels Enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) und Enzymgekoppelten Lektinadsorptionstest (ELLA) (Kapitel 6) wurde auf Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas angewendet, die mit verschiedenen Liganden mittels Inkubation und Einmischung funktionalisiert wurden. Das Modellmolek{\"u}l Biocytin, das biotinylierte Peptid GRGDSK-biotin, das ECM Protein Fibronektin (FN), als auch die Modellzucker N-Acetyl-glukosamin (GlcNAc) und N-Acetyllaktosamin (LacNAc) konnten spezifisch in verschiedenen Konzentrationen nachgewiesen werden. Beispielhaft seien hier Schichten auf Glas genannt, die mittels Einmischmethode mit GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden, da diese zum Vergleich in Kapitel 8 herangezogen wurden. Auf diesen Oberfl{\"a}chen wurde eine maximale Peptidkonzentration auf der Oberfl{\"a}che bei einem Peptid zu Prepolymer Verh{\"a}ltnis von 1/5 ermittelt. Neben diesen verschiedenen Quantifzierungsmethoden ist die in vitro Analyse mit Zellen nicht zu vernachl{\"a}ssigen (Kapitel 7). Hierzu wurden Hydrogele auf Glas aufgebracht und mit GRGDS mittels Einmischmethode funktionalisiert. Durch Z{\"a}hlen adh{\"a}renter prim{\"a}rer humaner dermaler Fibroblasten (HDF) auf Mikroskopbildern wurde eine maximale Zelladh{\"a}sion bei dem Peptid zu Prepolymer Verh{\"a}ltnis von 1/5 festgestellt. Hingegen wurde ein Verh{\"a}ltnis von 1/2 f{\"u}r optimale Zelladh{\"a}sion ermittelt, wenn Zellen zur Quantifizierung von den Hydrogelen abgel{\"o}st und im CASY® Zellz{\"a}hler quantifiziert wurden. Zus{\"a}tzlich wurde die Zellvitalit{\"a}t durch Messung intrazellul{\"a}rer Enzymaktivit{\"a}ten gemessen, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen Zellvitalit{\"a}t und GRGDS Konzentration hergestellt werden. Adh{\"a}rente HDFs waren in allen F{\"a}llen vital, unabh{\"a}ngig von der Ligandenkonzentration auf der Oberfl{\"a}che. Auch die Mausfibroblasten Zelllinie NIH L929 wurde auf Hydrogelen mit verschiedenen GRGDS zu Prepolymer Verh{\"a}ltnissen durch Z{\"a}hlen adh{\"a}renter Zellen auf Mikroskopbildern untersucht. Diese im Verh{\"a}ltnis zu HDFs wesentlich kleineren Mauszellen ben{\"o}tigten h{\"o}here GRGDS Konzentrationen (2/1) f{\"u}r maximale Zelladh{\"a}sion. Nach der Ligandenquantifizierung in Kapitel 3 bis 7, wurden diese Ergebnisse in Kapitel 8 miteinander verglichen. Hierzu wurden Messungen auf Hydrogelschichten verwendet, die mittels Einmischmethode funktionalisiert wurden. W{\"a}hrend die Quantifizierung mittels Radioaktivmessung in der gesamten Tiefe der Hydrogelschichten keine maximale Ligandenkonzentration ermitteln konnte, war in den oberen Bereichen der Schicht ein Maximum an Liganden bei 1/1 festzustellen (XPS, TOF-SIMS). SPR und SAW wurden zum Vergleich nicht herangezogen, da die Beschichtung auf Gold erst optimiert werden muss. Oberfl{\"a}chensensitive Quantifizierung mittels ELISA und Zelladh{\"a}sion, die lediglich die sterisch zug{\"a}nglichen Liganden auf einer Oberfl{\"a}che nachweisen, ergaben {\"u}bereinstimmend eine optimale Ligandenkonzentration f{\"u}r SA Bindung und Zelladh{\"a}sion bei einem Peptid zu Prepolymer Verh{\"a}ltnis von 1/5. Dies unterstreicht, wie wichtig der Vergleich der Methoden, als auch die Verwendung von oberfl{\"a}chensensitiven Methoden ist. Der dritten Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der biochemischen und strukturellen Nachahmung der komplexen extrazellul{\"a}ren Umgebung (Advanced ECM engineering), ein wichtiger Aspekt in der Biomaterialforschung, da zum gr{\"o}ßten Teil zwei-dimensionale Biomaterialien zum Einsatz kommen, die direkt mit Liganden kovalent funktionalisiert werden. Die ECM ist jedoch um ein Vielfaches komplexer und die bestm{\"o}gliche Nachahmung ist Voraussetzung f{\"u}r eine bessere Akzeptanz durch Zellen und Gewebe. In Kapitel 9 wurde eine M{\"o}glichkeit aufgezeigt, das ECM Protein FN nicht-kovalent {\"u}ber Zucker-Lektinbindungen zu immobilisieren. Ein Schichtaufbau von Hydrogel, dem darauf durch Mikrokontakt-druckverfahren (MCP) kovalent gebundenen Zucker Poly-N-Acetyllaktosamin (polyLacNAc) und den darauf nicht-kovalent gebundenen Galektin His6CGL2 und FN, konnte mit Fluoreszenzf{\"a}rbung elegant nachgewiesen werden. Optimale Konzentrationen f{\"u}r den Schichtaufbau wurden mittels ELLA/ELISA auf Hydrogelschichten ermittelt, die durch Inkubation mit dem Zucker funktionalisiert wurden. Nur der komplette Schichtaufbau konnte zufriedenstellende HDF Adh{\"a}sion vermitteln und im Vergleich zu Zellkulturpolystyrol (TCPS) Oberfl{\"a}chen konnten HDFs auf dem biomimetischen Schichtaufbau schneller adh{\"a}rieren und spreiten. Zudem wurde die Umorganisierung von auf Glas adsorbiertem FN, auf NCO-sP(EO-stat-PO) kovalent gebundenem FN und biomimetisch {\"u}ber polyLAcNAc-His6CGL2 gebundenem FN durch HDFs verglichen. Nur auf den biomimetischen Oberfl{\"a}chen schien eine Umorganisation durch die Zellen m{\"o}glich, wie sie auch in der ECM zu finden ist. Diese biomimetische und flexible Pr{\"a}sentation eines Proteins erwies sich als vielversprechende M{\"o}glichkeit eine biomimetischere Oberfl{\"a}che f{\"u}r Zellen zu schaffen, die eine optimale Biokompatibilit{\"a}t erm{\"o}glichen k{\"o}nnte. Auch die strukturelle Nachahmung der ECM ist eine vielversprechende Strategie zum Nachbau der ECM. In Kapitel 10 wurde ein Einschrittverfahren zur Herstellung synthetischer, bioaktiver und degradierbarer Faserkonstrukte durch Elektrospinnen zur Nachahmung der ECM pr{\"a}sentiert. In diesem System wurden durch Zugabe von NCO-sP(EO-stat-PO) als reaktives Additiv zu Poly(D,L-laktid-co-Glycolid) (PLGA) Fasern hergestellt, die mit einer ultrad{\"u}nnen, inerten Hydrogelschicht versehen waren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Verwendung von NCO-sP(EO-stat-PO) als Additiv die Adsorption von Rinderserumalbumin (BSA) im Vergleich zu PLGA um 99,2\% reduziert, die Adh{\"a}sion von HDFs verhindert und die Adh{\"a}sion von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) minimiert werden konnten. Spezifische Bioaktivierung wurde durch Zugabe von Peptidsequenzen zur Spinl{\"o}sung erreicht, welche kovalent in die Hydrogelschicht eingebunden werden konnten und kontrollierte Zell-Faser Interaktionen erm{\"o}glichten, Um die spezifische Zelladh{\"a}sion an solchen inerten Fasern zu erzielen, wurde GRGDS kovalent auf der Faseroberfl{\"a}che gebunden. Dies erfolgte durch Zugabe des Peptids zur Polymerl{\"o}sung vor dem Elektrospinnen. Als Negativkontrolle wurde die Peptidsequenz GRGES an die Faseroberfl{\"a}che gebunden, welche durch Zellen nicht erkannt wird. W{\"a}hrend die Verhinderung unspezifischer Proteinadsorption f{\"u}r die Peptidmodifizierten Fasern erhalten blieb, konnten HDFs lediglich auf den mit GRGDS Peptid modifizierten Fasern adh{\"a}rieren, proliferieren und nach zwei Wochen eine konfluente Zellschicht aus vitalen Zellen bilden. Zus{\"a}tzlich konnten MSCs auf GRGDS funktionalisierten Fasern adh{\"a}rieren. Liganden konnten auf Fasern quantifiziert werden, indem die ELISA Technik aus Kapitel 6 auf Faseroberfl{\"a}chen transferiert wurde. Um das Potential der biochemischen und strukturellen Nachbildung der ECM aufzuzeigen, wurden beide Ans{\"a}tze miteinander kombiniert. Die Immobilisierung von polyLacNAc auf die Hydrogelfasern durch Inkubation und der Schichtaufbau mit His6CGL2 und FN resultierte in HDF Adh{\"a}sion.},
  subject      = {Hydrogel},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dwertmann2012,
  author    = {Dwertmann, Anne},
  title     = {Impact of the Tumor Suppressor Arf on Miz1 and Sumoylation of Myc and Miz1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71876},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Upon oncogenic stress, the tumor suppressor Arf can induce irreversible cell cycle arrest or apoptosis, depending on the oncogenic insult. In this study, it could be shown that Arf interacts with Myc and the Myc-associated zinc-finger protein Miz1 to facilitate repression of genes involved in cell adhesion. Formation of a DNA-binding Arf/Myc/Miz1 complex disrupts interaction of Miz1 with its coactivator nucleophosmin and induces local heterochromatinisation, causing cells to lose attachment and undergo anoikis. The assembly of the complex relies on Myc, which might explain why high Myc levels trigger apoptosis and not cell cycle arrest in the Arf response. This mechanism could play an important role in eliminating cells harboring an oncogenic mutation. Arf furthermore induces sumoylation of Miz1 at a specific lysine by repressing the desumoylating enzyme Senp3. A sumoylation-deficient mutant of Miz1 however does not show phenotypic differences under the chosen experimental conditions. Myc can also be modified by Sumo by multisumoylation at many different lysines, which is unaffected by Arf. The exact mechanism and effect of this modification however stays unsolved.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Heupel2010,
  author    = {Heupel, Wolfgang-Moritz Felix},
  title     = {Role and modulation of cadherins in pathologic processes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-52716},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Ca2+ dependent cell adhesion molecules (cadherins) are central for a variety of cell and tissue functions such as morphogenesis, epithelial and endothelial barrier formation, synaptic function and cellular signaling. Of paramount importance for cadherin function is their specific extracellular adhesive trans-interaction. Cadherins are embedded in a cellular environment of intracellular and extracellular regulators that modify cadherin binding in response to various physiological and pathological stimuli. Most experimental approaches used for studying cadherin interaction however lack a physiological proof of principle mostly by not investigating cadherins in their physiological environment. In the present cumulative dissertation, experimental approaches were applied to characterize and modulate vascular endothelial (VE)-cadherin and desmocadherin functions in the (patho-)physiological contexts of endothelial permeability regulation and disturbance of epidermal barrier function, which is typical to the blistering skin disease pemphigus, respectively. Whereas VE-cadherin is a key regulator of the endothelial barrier that separates the blood compartment from the interstitial space of tissues, desmosomal cadherins are crucial for maintenance of epidermal integrity and separation of the external environment from the body's internal milieu. Cadherin functions were both investigated in cell-free and cell-based conditions: by using biophysical single molecule techniques like atomic force microscopy (AFM), cadherin function could be investigated in conditions, where contributions of intracellular signaling were excluded. These experiments were, however, compared and combined with cell-based experiments in which cadherins of epidermal or endothelial cell cultures were probed by laser force microscopy (laser tweezers), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and other techniques. The autoimmune blistering skin diseases pemphigus foliaceus (PF) and pemphigus vulgaris (PV) are caused by autoantibodies directed against the extracellular domains of the desmosomal cadherins desmoglein (Dsg) 1 and 3, which are important for epidermal adhesion. The mechanism of autoantibody-induced cell dissociation (acantholysis) in pemphigus, however, is still not fully understood. For the first time, it is shown by AFM force spectroscopy that pemphigus autoantibodies directly inhibit Dsg3 adhesion by steric hindrance but do not inhibit adhesion of Dsg1. However, the full pathogenicity of the autoantibodies depended on cellular signaling processes, since autoantibodies targeting Dsg1 also resulted in loss of cadherin-mediated adhesion in cell-based experiments. However, two other signaling pathways that have been reported to be involved in pemphigus pathogenesis, i.e. epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-Src activation, were not found to be important in this context. Furthermore, peptide-based modulators of cadherin functions were generated for Dsg1/3 and VE-cadherin. By comparing Dsg1, Dsg3 and VE-cadherin sequences to published X-ray structures of cadherin trans-interactions, specific amino acid sequences of the binding pockets of these cadherins were identified. Peptide versions of these motifs were synthesized and the antagonistic functions of these "single peptides" were validated by AFM force spectroscopy as well as by cell-based assays. By linking two single peptides in tandem, stabilization of cadherin bonds because of by cross-bridge formation between trans-interacting cadherins was demonstrated. Protective effects of tandem peptides were shown by partly preventing pemphigus autoantibody-induced acantholysis, or in the case of VE-cadherin, by stabilizing endothelial barrier properties against barrier disrupting agents like the Ca2+ ionophore A23187 and an inhibitory VE-cadherin antibody. Most importantly, VE-cadherin tandem peptides abolished microvascular hyperpermeability induced by the physiologic inflammatory agent tumor necrosis factor-α in the rat mesentery in vivo. Both classes of tandem peptides therefore can be considered as a starting point for the generation of potential therapeutic agents that might prevent cell dissociation in pemphigus and breakdown of the endothelial barrier under inflammatory conditions.},
  subject      = {Cadherine},
  language  = {en}
}