@phdthesis{Proels2004,
  author    = {Pr{\"o}ls, Reinhard},
  title     = {Regulation and function of extracellular invertases of tomato},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10260},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Wachstum und Entwicklung pflanzlicher Gewebe bedingen eine fortw{\"a}hrende Ver{\"a}nderung von Source-Sink Beziehungen. Gewebe mit einem Nettoexport (Source) oder - import (Sink) von Kohlenhydraten m{\"u}ssen ihren aktuellen Bedarf an Assimilaten entsprechend dem Entwicklungsstadium anpassen. Dar{\"u}ber hinaus haben Pflanzen als ortsgebundene Lebewesen Regulationsmechanismen entwickelt, die eine flexible Antwort der Assimilatverteilung auf spezielle Anforderungen des Habitats, wie biotische oder abiotische Stressfaktoren und wechselnde Lichtbedingungen, erm{\"o}glichen. Die Assimilatverteilung ist vielf{\"a}ltig reguliert und erfordert spezifische Enzymfunktionen, wie Zuckertransporter und saccharosespaltende Enzyme. Extrazellul{\"a}re Invertasen nehmen eine essentielle Funktion in der apoplastischen Phloementladung und in der Regulation von Source-Sink {\"U}berg{\"a}ngen ein. Dies spiegelt sich in dem Auftreten verschiedener Invertase- Isoenzyme mit speziellen Expressions- und Regulationsmustern wider, welche eine Koordination des Kohlenhydratmetabolismus in unterschiedlichen Geweben, zu unterschiedlichen Entwicklungsstufen und unter sich {\"a}ndernden Umweltbedingungen erm{\"o}glichen. Ein detailliertes Wissen {\"u}ber die Funktion extrazellul{\"a}rer Invertasen k{\"o}nnte eingesetzt werden, um Wachstum, Entwicklung oder Pathogenresisitenz von Nutzpflanzen gezielt zu ver{\"a}ndern. In der vorliegenden Studie wurden die Regulationsmuster und die Funktion dreier extrazellul{\"a}rer Invertasen aus Tomate, Lin5, Lin6 und Lin7 untersucht. Durch umfangreiche Promotorstudien konnte eine gewebe- und entwicklungsspezifische Expression dieser Isoenzyme und entsprechende Regulationsmuster offengelegt werden. Lin5 zeigt eine entwicklungsabh{\"a}ngige Expression in Fr{\"u}chten. Lin6 wird in fr{\"u}hen Entwicklungsstadien, beginnend mit der Samenkeimung, exprimiert; in ausgewachsenen Pflanzen ist eine Lin6 Expression nur in Pollen oder nach Verwundungsinduktion nachweisbar. Lin7 wird ausschließlich in Tapetum-Gewebe und Pollen exprimiert. Die hormonelle Regulation der Isogene wurde im Detail untersucht, hierbei konnten bekannte Ph{\"a}notypen, welche durch Gibberellins{\"a}ure und Jasmonate bedingt werden, mit Invertasefunktionen in Korrelation gebracht werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte in einem funktionalen Ansatz gezeigt werden, dass Lin7 eine wichtige Rolle in der Pollenkeimung zukommt. Die vorliegende Arbeit stellt die umfassendste Untersuchung extrazellul{\"a}rer Invertasen w{\"a}hrend der Bl{\"u}tenentwicklung dar, an der drei Isoenzyme aus Tomate beteiligt sind. Dadurch, dass den einzelnen Invertasen Lin5, Lin6 und Lin7 individuelle Funktionen zugewiesen werden konnten, er{\"o}ffnen sich neue Erkenntnisse {\"u}ber die Kohlenhydratversorgung w{\"a}hrend der Bl{\"u}ten- und Fruchtentwicklung. F{\"u}r die untersuchten gewebespezifischen Promotoren er{\"o}ffnen sich zudem Anwendungsm{\"o}glichkeiten in der Biotechnologie, was insbesondere f{\"u}r den pollenspezifischen Lin7 Promotor zutrifft. Es konnte gezeigt werden, dass der Lin6 Promotor das Ziel von hormon-, zucker- und verwundungsvermittelten Signalwegen ist. Dar{\"u}ber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Elemente des circadianen Oszillators von A. thaliana mit dem Lin6 Promotor funktionell interagieren und die Lin6 Expression einem diurnalen Rhythmus unterliegt. Dieses komplexe Regulationsmuster spiegelt sich in vielen cis-aktiven Elementen wider, die im Lin6 Promotor vorgefunden wurden. Durch dieses Merkmal wird die These gest{\"u}tzt, dass verschiedene Stimuli {\"u}ber die extrazellul{\"a}re Invertase integriert werden und so eine koordinierte Zellantwort auf sich {\"a}ndernde interne und externe Bedingungen erm{\"o}glicht wird. Nachdem Zuckermolek{\"u}le ihrerseits die Expression von Lin6 induzieren, wird dadurch eine Amplifikation von Signalen {\"u}ber eine positive R{\"u}ckkopplungsschleife erm{\"o}glicht. Die Vielzahl an cis-aktiven Elementen und deren Anordnung im Lin6 Promotor stellen ein ideales Modellsystem dar, um Fragen in Bezug auf Signalinteraktion und -integration zu untersuchen. In einer umfangreichen Studie wurde der Lin6 Promotor erfolgreich als induzierbares Expressionssystem eingesetzt. Hierbei wurde ein Invertaseinhibitor unter der Kontrolle des cytokinininduzierbaren Lin6 Promotors in transgenen Tabakpflanzen exprimiert. Mit diesem Ansatz ist es gelungen einen kausalen Zusammenhang zwischen dem Hormon Cytokinin und extrazellul{\"a}ren Invertasen in der Seneszenzverz{\"o}gerung herzustellen. Diese Studie zeigt, dass induzierbare Expressionssysteme essentiell sind, um spezifische Fragestellungen auf molekularer Ebene kl{\"a}ren zu k{\"o}nnen. Bei der Klonierung obig genannter Promotorsequenzen haben sich zudem zwei interessante strukturelle Besonderheiten ergeben. Zum einen sind die Gene von Lin5 und Lin7 in einem Tandem auf dem Genom angeordnet, zum anderen konnte eine Transposoninsertion im Intron I des Lin5 Gens gezeigt werden. Mit einem Primerpaar, das aus der Transposaseregion dieses Transposons abgeleitet wurde, konnten entsprechende Sequenzen von mehreren Solanaceae Spezies gewonnen werden.},
  subject      = {Tomate},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Luo2004,
  author    = {Luo, Qin},
  title     = {Essential features of a PrfA-dependent : promoter of Listeria monocytogenes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10341},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {The gram-positive, facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis. Most of well-known virulence genes are controlled by PrfA that belongs to the Crp-Fnr family of transcriptional activators. A PrfA-mediated transcription initiating at a virulence gene promoter, inlC promoter (PinlC) that regulates the expression of the small, secreted internalin C, was in-depth characterized by an in vitro transcription system to unravel the essential features of a PrfA-dependent promoter in this study. The obtained results indicate a dual promoter for inlC that leads to PrfA-dependent and -independent transcription in vitro and in vivo. The PrfA-dependent transcription requires, as expected, the PrfA-box, a conserved 14 bp sequence of dyad symmetry located about 40 bp upstream of the transcriptional start site of each PrfA-regulated gene. Another important structural feature for this PrfA-dependent promoter is the distance between the 3´-end of the PrfA-box and the 5´-end of the SigA-recognized -10 box fixed to 22 or 23 bp, which is observed in the interspace regions of the other known PrfA-dependent promoters, e.g. PactA, PplcA, Phly and Pmpl. The -35 box of PinlC is not necessary for PrfA-dependent transcription. The -10 box of PinlC and also that of the other PrfA-dependent promoters of L. monocytogenes closely resemble SigA-recognized -10 promoter sequences of the well-characterized gram-positive bacterium B. subtilis. Even the extended -10 motif (5´-TRTG-3´) considered to be a basic element for many SigA-recognized promoters in B. subtilis is present in PinlC. Primer extension studies reveal that both the PrfA-dependent and the independent promoter share the same -10 box. The PrfA-independent transcription of inlC depends on a -35 box located directly downstream of the PrfA-box, and the close proximity of the two sites inhibits strongly the transcription activity of the PrfA-independent promoter when the PrfA-RNA polymerase complex binds to the PrfA-box. Deletion of the PrfA-box results in PrfA-independent transcription from PinlC, which is no longer inhibited by PrfA. High concentration of GTP appears to be necessary for PrfA-dependent transcription initiated at the inlC promoter and at other PrfA-dependent promoters. Based on transcriptome analysis, Milohanic and his co-workers identified three groups of genes that were regulated differently by PrfA. Some of these genes containing putative PrfA-boxes in their 5´-upstream regulatory regions were selected for analysis of their transcriptional dependency on PrfA using again the in vitro transcription system. The data show that among these "PrfA-regulated" promoters tested, only the promoter of the hpt gene belonging to group I is clearly activated by PrfA. This promoter is also the only one that exhibited all essential features of a typical PrfA-dependent promoter as described above. In vitro transcription starting at most of the other promoters was neither positively nor negatively affected by PrfA. Transcription initiated at some of the promoters of group III genes (lmo0596 and lmo2067) is rather inefficient with SigA-loaded RNA polymerase, but is highly activated with RNA polymerase loaded with purified SigB. Addition of purified PrfA protein has no effect on the SigB-dependent transcription. These in vitro transcription results indicate that the in vivo observed PrfA effect on the expression of most of the new genes is either indirect or PrfA-mediated transcription of these genes requires - in contrast to the PrfA-dependent transcription of the known virulence genes (including hpt) - additional factors not present in the in vitro transcription assay. In addition to these new genes described by Milohanic, the promoters of two genes (lmo2420 and lmo2840) that contain putative PrfA-boxes with only a single mismatch in their upstream regulatory regions were analyzed in this study. However, transcription of none of these genes is regulated by PrfA, suggesting that these genes are either not truly regulated by PrfA or regulated by other global transcription activators that interact with PrfA by yet unknown mechanisms. By exchanging corresponding sequences between a functionally inactive promoter ParoAP2 and a typical PrfA-dependent promoter PplcA, it is found that PrfA-dependent in vitro transcription can be initiated from the hybrid promoter containing the putative PrfA-box and the SigA-recognized -10 box (TTTAAT) from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter, but it is inhibited strongly by the interspace sequence between these two sites apparently due to an additional RNA polymerase binding site [the -10 box (TAATAT) for the PrfA-independent transcription of ParoAP1)] within this region. Furthermore, a symmetric sequence downstream of the -10 box (TTTAAT) is also shown to be a strongly inhibitory for PrfA-dependent transcription from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter.},
  subject      = {Listeria monocytogenes},
  language  = {en}
}