@phdthesis{Lee2013,
  author    = {Lee, Wook},
  title     = {Computational study on the catalytic mechanism of mtKasA},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83989},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Das Enzym KasA spielt eine entscheidende Rolle in der Biosynthese von Mykols{\"a}uren, den Bausteinen der Zellw{\"a}nde von Mycobacteriumtuberculosis. Dessen essentielle Notwendigkeit zeigt sich bei Abwesenheit von KasA in einer Zelllyse (Aufl{\"o}sung von Zellen) bei Mycobacteriumtuberculosis. Durch seine Bedeutung f{\"u}r Mycobacteriumtuberculosis, dem Erreger von Tuberkulose und damit der zweith{\"a}ufigsten Todesursache durch Infektionskrankheiten, stellt KasA ein vielversprechendes Ziel f{\"u}r die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dar. Durch das Auftreten von extensiv resistenten St{\"a}mmen welche die meisten bekannten Antibiotika zur Bek{\"a}mpfung von Tuberkulose inaktivieren wird es dringend notwendig neue Medikamente gegen Tuberkulose zu entwickeln. In Kapitel 3.1 wird der Protonierungszustand der katalytischen Reste im Ruhezustand untersucht. F{\"u}r diese Untersuchungen wurden Free Energy Perturbation (FEP) Rechnungen und MD Simulationen verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass der zwitterionische Zustand am wahrscheinlichsten ist. Um diese Aussage mit weiteren handfesten Daten zu untermauern wurden Potential(hyper)fl{\"a}chen (PES) f{\"u}r den Protonentransfer zwischen neutralen und zwitterionischen Zustand mit Hilfe von QM/MM Methoden berechnet. Durch die starke Abh{\"a}ngigkeit der QM/MM Optimierung von der Ausgangsstruktur war es nicht m{\"o}glich konsistente Ergebnisse f{\"u}r diese Berechnungen zu bekommen. Um dieses Problem zu umgehen wurde ein auf QM/MM basierendes Umbrella Sampling mit Semiempirischen Methoden (RM1) durchgef{\"u}hrt. Die sich daraus ergebende PMF Fl{\"a}che zeigt das der zwitterionische Zustand stabiler ist als der neutrale Zustand. In Kapitel 3.2 wurde der Protonierungszustand der entsprechenden Reste im Acyl-Enzym Zustand untersucht. Im Unterschied zu anderen katalytischen Resten ist der Protonierungszustand von His311 ist nicht eindeutig im Acyl-Enzym Zustand und es ergeben sich aus den verschiedenen Protonierungszust{\"a}nden verschiedene Decarboxylierungsmechanismen. Um den wahrscheinlichsten Protonierungszustand bez{\"u}glich der freien Energie zu bestimmen wurden FEP Rechnungen durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse zeigen, dass der pKa Wert an Nδ betr{\"a}chtlich durch die Enzymumgebung verringert wird, w{\"a}hrend dies f{\"u}r Nε nicht der Fall ist. Zus{\"a}tzlich dazu wurden die PMF Profile f{\"u}r den Protonentransfer zwischen Lys340 und Glu354 mit der QM/MM basierten Umbrella Sampling Methode berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass das Lys340/Glu354 Paar eher neutral als ionisch ist, wenn His311 an Nε protoniert ist. Ein relativ hoher ionischer Charakter des Lys340/Glu354 Paares, wenn His311 doppelt protoniert ist, gibt einen wertvollen Einblick in die Rolle welche das Lys340/Glu354 Paar beim verschieben des Protonierungszustandes von Nδ zu Nε im His311 nach dem Acyltransferschritt spielt. Die Ergebnisse zeigen, dass His311 neutral und an Nε protoniert ist. Ebenso ist das Lys340/Glu354 Paar neutral im Acyl-Enzym Zustand. Diese berechneten Ergebnisse f{\"u}hren zu dem Schluss, dass die Decarboxylierung durch ein Oxyanion Loch erleichtert wird welches aus zwei katalytischen Histidin Resten besteht. In Kapitel 3.3 wurde der Protonierungszustand der katalytischen Reste im Ruhezustand erneut untersucht da eine aktuelle Benchmarkstudie zeigte, dass die verwendete Semiempirische Methode (RM1) in Kapitel 3.1 dazu tendiert die Stabilisation des zwitterionischen Zustandes zu {\"u}bersch{\"a}tzen. Auch wurde in Kapitel 3.1 das Lys340/Glu354 Paar als rein ionisch angesehen, w{\"a}hrend sich in Kapitel 3.2 herausstellte, dass es sich um eine Mischung aus neutralen und ionischen Charakter handelt. Die neuen Untersuchungen beinhalten eine gr{\"o}ßere QM Region inklusive des Lys340/Glu354 Paares. Der daf{\"u}r verwendete BLYP/6-31G** Ansatz ist ausreichend akkurat f{\"u}r die aktuelle Fragestellung, was durch Vergleichsrechnungen bewiesen wurde. Die neuen Ergebnisse der QM/MM MD und FEP Rechnungen deuten an, dass die katalytischen Reste im Ruhezustand h{\"o}chst wahrscheinlich neutral vorliegen. Dies wiederum f{\"u}hrt zu der Frage wie KasA aktiviert werden kann um die katalytische Reaktion zu initiieren. Auf der Basis der Ergebnisse der MD Simulationen und FEP Rechnungen f{\"u}r den His311Ala Mutanten in Kapitel 3.1 stellten wir die Hypothese auf, dass die offene Konformation von Phe404 die Aktivierung der katalytischen Reste durch die (Aus)bildung einer starken Wasserstoffbindung einleitet. Die QM/MM MD Simulation best{\"a}tigt dass diese Aktivierung der katalytischen Reste durch die offene Konformation des Phe404 bewerkstelligt werden kann. Das entsprechende auf Kraftfeld basierende PMF Profil zeigt auch, dass dieser Konformationswechsel energetisch realisierbar ist. Die Verteilung der hydrophilen und hydrophoben Reste in der Malonyl Bindungstasche in Verbindung mit unseren berechneten Ergebnissen geben einen Einblick in den detaillierten},
  subject      = {Tuberkelbakterium},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Paasche2013,
  author    = {Paasche, Alexander},
  title     = {Mechanistic Insights into SARS Coronavirus Main Protease by Computational Chemistry Methods},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-79029},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {The SARS virus is the etiological agent of the severe acute respiratory syndrome, a deadly disease that caused more than 700 causalities in 2003. One of its viral proteins, the SARS coronavirus main protease, is considered as a potential drug target and represents an important model system for other coronaviruses. Despite extensive knowledge about this enzyme, it still lacks an effective anti-viral drug. Furthermore, it possesses some unusual features related to its active-site region. This work gives atomistic insights into the SARS coronavirus main protease and tries to reveal mechanistic aspects that control catalysis and inhibition. Thereby, it applies state-of-the-art computational methods to develop models for this enzyme that are capable to reproduce and interpreting the experimental observations. The theoretical investigations are elaborated over four main fields that assess the accuracy of the used methods, and employ them to understand the function of the active-site region, the inhibition mechanism, and the ligand binding. The testing of different quantum chemical methods reveals that their performance depends partly on the employed model. This can be a gas phase description, a continuum solvent model, or a hybrid QM/MM approach. The latter represents the preferred method for the atomistic modeling of biochemical reactions. A benchmarking uncovers some serious problems for semi-empirical methods when applied in proton transfer reactions. To understand substrate cleavage and inhibition of SARS coronavirus main protease, proton transfer reactions between the Cys/His catalytic dyad are calculated. Results show that the switching between neutral and zwitterionic state plays a central role for both mechanisms. It is demonstrated that this electrostatic trigger is remarkably influenced by substrate binding. Whereas the occupation of the active-site by the substrate leads to a fostered zwitterion formation, the inhibitor binding does not mimic this effect for the employed example. The underlying reason is related to the coverage of the active-site by the ligand, which gives new implications for rational improvements of inhibitors. More detailed insights into reversible and irreversible inhibition are derived from in silico screenings for the class of Michael acceptors that follow a conjugated addition reaction. From the comparison of several substitution patterns it becomes obvious that different inhibitor warheads follow different mechanisms. Nevertheless, the initial formation of a zwitterionic catalytic dyad is found as a common precondition for all inhibition reactions. Finally, non-covalent inhibitor binding is investigated for the case of SARS coranavirus main protease in complex with the inhibitor TS174. A novel workflow is developed that includes an interplay between theory and experiment in terms of molecular dynamic simulation, tabu search, and X-ray structure refinement. The results show that inhibitor binding is possible for multiple poses and stereoisomers of TS174.},
  subject      = {SARS},
  language  = {en}
}