@phdthesis{Fouquet2008,
  author    = {Fouquet, Wernher},
  title     = {Analysis of synapse assembly in Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38173},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {The majority of rapid cell-to-cell communication mechanisms and information processing within the nervous system makes use of chemical synapses. Fast neurotransmission on these sites not only requires very close apposition of pre- and postsynaptic partners, but also depends on an effective structural arrangement of cellular components on both sides of the synaptic cleft. Synaptic vesicles fuse at active zones (AZs), characterized by an electron-dense protein mesh of insufficiently characterized composition and function. EM analysis of synapses identified electron dense structures thought (but not proven) to play an important role for vesicle release efficacy. The molecular organization of presynaptic AZs during Ca2+ influx-triggered neurotransmitter release is currently a focus of intense investigation. Due to its appearance in electron micrographs, dense bodies at Drosophila synapses were named T-bars. Together with the lab of Erich Buchner, we recently showed that Bruchpilot (BRP) of the Drosophila melanogaster, homologous to the mammalian CAST/ERC family in its N-terminal half, is essential for the T-bar assembly at AZs and efficient neurotransmitter release respectively. The question, in which way BRP contributes to functional and structural organization of the AZ, was a major focus of this thesis. First, stimulated emission depletion microscopy (STED), featuring significantly increased optical resolution, was used to achieve first insights into 'cytoarchitecture' of the AZ compartment. In addition, in vivo live imaging experiments following identified populations of synapses over extended periods were preformed to address the trafficking of protein at forming synapses and thereby providing a temporal sequence for the AZ assembly process. Apart from BRP, two additional AZ proteins, DLiprin-\&\#945; and DSyd-1, were included into the analysis, which were both shown to contribute to efficient AZ assembly. Drosophila Syd-1 (DSyd-1) and Drosophila Liprin-\&\#945; (DLiprin-\&\#945;) clusters initiated AZ assembly, finally forming discrete 'quanta' at the AZ edge. ELKS-related Bruchpilot, in contrast, accumulated late from diffuse pools in the AZ center, where it contributed to the electron dense specialization by adopting an extended conformation vertical to the AZ membrane. We show that DSyd-1 and DLiprin-\&\#945; are important for efficient AZ formation. The results of this thesis describe AZ assembly as a sequential protracted process, with matured AZs characterized by sub-compartments and likely quantal building blocks. This step-wise, in parts reversible path leading to mature AZ structure and function offers new control possibilities in the development and plasticity of synaptic circuits.},
  subject      = {Synapse},
  language  = {en}
}
@phdthesis{PimentelElardo2008,
  author    = {Pimentel Elardo, Sheila Marie},
  title     = {Novel anti-infective secondary metabolites and biosynthetic gene clusters from actinomycetes associated with marine sponges},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40463},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Marine sponges (Porifera) harbor diverse microbial communities within their mesohyl, among them representatives of the phylum Actinobacteria, commonly known as actinomycetes. Actinomycetes are prolific producers of pharmacologically important compounds and are responsible for producing the majority of antibiotics. The main aim of this Ph.D. study was to investigate the metabolic potential of the sponge-associated actinomycetes to produce novel anti-infective agents. The first aim was to cultivate actinomycetes derived from different marine sponges. 16S rDNA sequencing revealed that the strains belonged to diverse actinomycete genera such as Gordonia, Isoptericola, Micromonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora and Streptomyces. Phylogenetic analyses and polyphasic characterization further revealed that two of these strains represent new species, namely Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T (Pimentel-Elardo et al. 2008a) and Streptomyces axinellae strain Pol001T (Pimentel-Elardo et al. 2008b). Furthermore, secondary metabolite production of the actinomycete strains was investigated. The metabolites were isolated using a bioassay-guided purification scheme followed by structure elucidation using spectroscopic methods and subjected to an elaborate anti-infective screening panel. Several interesting compounds were isolated namely, the novel polyketides cebulactam A1 and A2 (Pimentel-Elardo et al. 2008c), a family of tetromycin compounds including novel derivatives, cyclodepsipeptide valinomycin, indolocarbazole staurosporine, diketopiperazine cycloisoleucylprolyl and butenolide. These compounds exhibited significant anti-parasitic as well as protease inhibitory activities. The third aim of this Ph.D. study was to identify biosynthetic gene clusters encoding for nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS) present in the actinomycete strains. Genomic library construction and sequencing revealed insights into the metabolic potential and biosynthetic pathways of selected strains. An interesting NRPS system detected in Streptomyces sp. strain Aer003 was found to be widely distributed in several sponge species, in an ascidian and in seawater and is postulated to encode for a large peptide molecule. Sequencing of the PKS gene cluster of Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T allowed the prediction of the cebulactam biosynthetic pathway which utilizes 3-amino-5-hydroxybenzoic acid as the starter unit followed by successive condensation steps involving methylmalonyl extender units and auxiliary domains responsible for the polyketide assembly. In conclusion, this Ph.D. study has shown that diverse actinomycete genera are associated with marine sponges. The strains, two of them novel species, produced diverse chemical structures with interesting anti-infective properties. Lastly, the presence of biosynthetic gene clusters identified in this study substantiates the biosynthetic potential of actinomycetes to produce exploitable natural products and hopefully provides a sustainable supply of anti-infective compounds.},
  subject      = {Meeresschw{\"a}mme},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Dabas2008,
  author    = {Dabas, Neelam},
  title     = {Control of Nitrogen Regulated Virulence Traits of the Human Fungal Pathogen Candida albicans},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29769},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Der Hefepilz Candida albicans ist ein harmloser Kommensale auf den Schleimh{\"a}uten des Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Bei einer St{\"o}rung der nat{\"u}rlichen Mikroflora oder des Wirtsimmunsystems kann der Pilz jedoch auch oberfl{\"a}chliche und sogar systemische Infektionen verursachen. C. albicans weist eine Reihe von Eigenschaften auf, die zur Virulenz des Erregers beitragen. Dazu geh{\"o}ren die Adh{\"a}renz an unterschiedliche Wirtsoberfl{\"a}chen, die morphologische Variabilit{\"a}t des Pilzes und die Sekretion von Aspartatproteasen. Die Expression vieler dieser Virulenzfaktoren wird unter anderem durch die Verf{\"u}gbarkeit von Stickstoff reguliert. Unter Stickstoffmangelbedingungen wechselt C. albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum filament{\"o}sen Wachstum, und dieser Wechsel wird durch die Ammoniumpermease Mep2p reguliert. Wie die Induktion des filament{\"o}sen Wachstums durch Mep2p kontrolliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse von Mep2p durchgef{\"u}hrt, um Aminos{\"a}uren zu identifizieren, die an der Signalfunktion dieser Permease beteiligt sind. Die C-terminale cytoplasmatische Dom{\"a}ne von Mep2p wird f{\"u}r den Ammoniumtransport nicht ben{\"o}tigt, ist jedoch essentiell f{\"u}r die Signaltransduktion. Progressive C-terminale Verk{\"u}rzungen von Mep2p zeigten, dass ein MEP2DC433-Allel immer noch in der Lage war, das filament{\"o}se Wachstum zu induzieren, wohingegen die Deletion einer weiteren Aminos{\"a}ure die Morphogenese blockierte. Das Tyrosin an Position 433 (Y433) ist deshalb die letzte Aminos{\"a}ure, die f{\"u}r die Signalfunktion von Mep2p essentiell ist. Um besser zu verstehen, wie die Signalaktivit{\"a}t von Mep2p durch die Verf{\"u}gbarkeit und den Transport von Ammonium reguliert wird, wurden verschiedene hochkonservierte Aminos{\"a}uren mutiert, die vermutlich an der Bindung oder dem Transport von Ammonium in die Zelle beteiligt sind. Die Mutation von D180, von dem postuliert wurde, dass es den initialen Kontakt mit extrazellul{\"a}rem Ammonium erm{\"o}glicht, oder der im Transportkanal lokalisierten Histidine H188 und H342 hatte zur Folge, dass Mep2p nicht mehr exprimiert wurde, so dass diese Aminos{\"a}uren vermutlich f{\"u}r die Proteinstabilit{\"a}t wichtig sind. Die Mutation von F239, das zusammen mit F126 eine extracytosolische Pforte zur Transportpore bildet, verhinderte trotz korrekter Membranlokalisation sowohl den Ammoniumtransport als auch das filament{\"o}se Wachstum. Allerdings f{\"u}hrte auch die Mutation von W167, das vermutlich zusammen mit Y122, F126 und S243 an der Rekrutierung des Ammoniumions an der extrazellul{\"a}ren Seite der Membran beteiligt ist, zur Blockierung des filament{\"o}sen Wachstums, obwohl der Ammoniumtransport kaum beeinflusst war. Dies zeigte, dass die intrazellu{\"a}re Signaltransduktion durch extrazellul{\"a}re Ver{\"a}nderungen in Mep2p beeinflusst werden kann. Die Mutation von Y122 reduzierte die Ammoniumaufnahme weitaus starker als die Mutation von W167, erlaubte jedoch immer noch ein effizientes filament{\"o}ses Wachstum. Die Signalaktivit{\"a}t von Mep2p ist deshalb offensichtlich nicht direkt mit der Transportaktivit{\"a}t des Proteins korreliert. Ein wichtiger Aspekt in der F{\"a}higkeit von Mep2p, die Morphogenese zu stimulieren, ist die vergleichsweise starke Expression des Proteins. Um die Regulation der MEP2-Expression aufzukl{\"a}ren, wurden die cis-regulatorischen Sequenzen und die trans-aktivierenden Faktoren, die die MEP2-Induktion unter Stickstoffmangel vermitteln, identifiziert. Eine Promotoranalyse zeigte, dass zwei mutmaßliche Bindungsstellen f{\"u}r GATA-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle in der MEP2-Expression haben, da die Deletion oder Mutation dieser GATAA-Sequenzen die Expression von MEP2 stark reduzierte. Um die Rolle der GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p bei der Regulation der MEP2-Expression zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die entsprechenden Gene deletiert waren. Die Expression von Mep2p war in gln3D und gat1D Einzelmutanten stark verringert und in gln3D gat1D Doppelmutanten nicht mehr nachweisbar. Die Deletion von GLN3 hatte auch eine starke Reduktion des filament{\"o}sen Wachstums zur Folge, die durch die konstitutive Expression von MEP2 unter Kontrolle des ADH1-Promotors aufgehoben wurde. Dagegen hatte die Deletion von GAT1 keinen Einfluss auf das filament{\"o}se Wachstum. {\"U}berraschenderweise war das filament{\"o}se Wachstum in den gat1D Mutanten teilweise unabh{\"a}ngig von Mep2p, was darauf hinwies, dass in Abwesenheit von GAT1 andere Signalwege aktiviert werden, die die Morphogenese stimulieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p die Expression der Ammoniumpermease MEP2 kontrollieren und dass Gln3p auch ein wichtiger Regulator des durch Stickstoffmangel induzierten filament{\"o}sen Wachstums von C. albicans ist. Mutanten, in denen die beiden GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p fehlten, waren nicht mehr in der Lage, in einem Medium zu wachsen, das bovines Serumalbumin (BSA) als einzige Stickstoffquelle enth{\"a}lt. Die F{\"a}higkeit von C. albicans, Proteine als einzige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden, wird durch die sekretierte Aspartatprotease Sap2p, die die Proteine zu Peptiden abbaut, und durch Oligopeptidtransporter, die diese Peptide in die Zelle aufnehmen, vermittelt. Der Wachstumsdefekt der gln3D gat1D Doppelmutanten war haupts{\"a}chlich durch einen Defekt in der SAP2-Expression verursacht, da die Expression von SAP2 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors die F{\"a}higkeit zum Wachstum auf BSA wieder herstellte. Es zeigte sich, dass Gln3p und Gat1p die Expression des Transkriptionsfaktors STP1, der f{\"u}r die Induktion von SAP2 in Gegenwart von Proteinen notwendig ist, regulieren. Bei einer Expression von STP1 unter Kontrolle des induzierbaren Tet-Promotors waren Gln3p und Gat1p nicht mehr notwendig f{\"u}r das Wachstum auf Proteinen. Wenn bevorzugte Stickstoffquellen verf{\"u}gbar sind, wird SAP2 auch in Gegenwart von Proteinen reprimiert, und diese Stickstoff-Katabolitrepression korrelierte mit einer reduzierten STP1-Expression. Die Expression von STP1 unter Kontrolle des Tet-Promotors hob diese Repression auf, was zeigte, dass die Regulation der STP1-Expression durch die GATA-Transkriptionsfaktoren eine Schl{\"u}sselrolle sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Kontrolle der SAP2-Expression spielt. Eine regulatorische Kaskade, in der die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors Stp1p durch die allgemeinen Regulatoren Gln3p und Gat1p kontrolliert wird, stellt die Expression von SAP2 in C. albicans deshalb unter Stickstoffkontrolle und gew{\"a}hrleistet eine angepasste Expression dieses Virulenzfaktors. Die Ergebnisse dieser Arbeit illustrieren, dass die GATA-Faktoren Gln3p und Gat1p zum Teil {\"u}berlappende aber auch spezifische Funktionen in der Anpassung von C. albicans an die Verf{\"u}gbarkeit verschiedener Stickstoffquellen haben. Diese Anpassungsmechanismen spielen auch eine Rolle in der Pathogenit{\"a}t des Pilzes, wobei die relative Bedeutung von Gln3p und Gat1p vom Zielgen und der Stickstoffquelle abh{\"a}ngt. Diese Erkenntnisse geben einen vertieften Eiblick in die molekularen Grundlagen der Anpassung von C. albicans an unterschiedliche Umweltbedingungen.},
  subject      = {Transkriptionsfaktor},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Hotz2008,
  author    = {Hotz, Christian},
  title     = {Improvement of Salmonella vaccine strains for cancer immune therapy based on secretion or surface display of antigens},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29548},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Cancer immune therapy represents a promising alternative to conventional anti tumour therapy like radiation, surgical excision of the tumour or classical chemotherapy. The biggest advantage of cancer immune therapy is specificity, achieved by targeting tumour-associated antigens with the effector arms of the host immune system. This is believed to result in less adverse effects than standard therapy and reaches presumably also metastatic lesions at distant sites from the primary tumour. However, cancer immune therapy by vaccination against tumour antigens failed to translate into clinical success, yet. Furthermore, despite tremendous clinical efforts malignant disease still results in high mortalities giving rise to the need for novel vaccination-based therapies against cancer. An interesting approach in this respect is the use of bacteria like attenuated salmonellae as carriers for heterologous cancer antigens. In numerous preclinical studies Salmonella-based vaccines could elicit cell mediated immune responses of the CD4+ and CD8+ type against own and heterologous antigens which make them ideally suited for anti tumour therapy. Special delivery systems in Salmonella carriers like surface display or secretion of antigens were shown to be advantageous for the immunological outcome. This work focussed on developing novel Salmonella carriers for immune therapy against cancer. In a first project, TolC, a multifunctional outer membrane protein of E. coli was utilized as membrane anchor for 3 heterologous antigens. Respective TolC fusion proteins encoded on plasmids were analysed for expression, functionality and plasmid stability in different engineered Salmonella strains. The amount of membrane localized recombinant TolC was enhanced in tolC-deficient strains. Furthermore, fusion proteins were functional and plasmid stability was very high in vitro and in vivo. Disappointingly, neither specific CD4+/CD8+ T-cell responses against the model antigen ovalbumin nor CD8+ responses against the cancer antigen BRAFV600E were detectable in murine model systems. However, mice immunized with Salmonella strains displaying an immunodominant epitope of the cancer related prostate specific antigen (PSA) were partially protected from subsequent tumour challenge with a PSA expressing melanoma cell line. Tumour growth in mice immunized with the respective strain was significantly decelerated compared to controls, thus indicating that this surface display system confers protective immunity against tumours. In a second study, the approved typhoid vaccine strain Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a (Ty21a) was improved for the hemolysin type I secretion system of E. coli. This secretion system is widely used for heterologous antigen delivery in live bacterial vaccines. It was demonstrated throughout this work that a mutation of rpoS in Ty21a correlated with decreased ability for hemolysin secretion compared to other Salmonella strains. Complementation with rpoS or the presumed downstream target of rpoS, rfaH resulted in enhanced expression and secretion of heterologous hemolysin in Ty21a. Presumably by raising the amount of free antigen, rfaHcomplemented Ty21a elicited higher antibody titres against heterologous hemolysin in immunized mice than controls and even rpoS-positive Ty21a. Therefore, rfaHcomplemented Ty21a could form the basis of a novel generation of vaccines for human use based on (cancer) antigen secretion.},
  subject      = {Impfstoff},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Gelmedin2008,
  author    = {Gelmedin, Verena Magdalena},
  title     = {Targeting flatworm signaling cascades for the development of novel anthelminthic drugs},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33334},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Echinococcus multilocularis verursacht die Alveol{\"a}re Echinokokkose (AE), eine lebendsbedrohliche Krankheit mit limitierten chemotherapeutischen M{\"o}glichkeiten. Die jetzige Anti-AE Chemotherapie basiert auf einer einzigen Wirkstoffklasse, den Benzimidazolen. Obwohl Benzimidazole in vitro parasitozid wirken, wirken sie in vivo bei AE-Behandlung lediglich parasitostatisch und rufen schwere Nebenwirkungen hervor. In F{\"a}llen operabler L{\"a}sionen erfordert die Resektion des Parasitengewebes {\"u}ber einen l{\"a}ngeren Zeitraum eine chemotherapeutische Unterst{\"u}tzung. Damit sind die jetzigen Behandlungsm{\"o}glichkeiten inad{\"a}quat und ben{\"o}tigen Alternativen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Signalwege von Plattw{\"u}rmern analysiert, um potentielle Targets f{\"u}r neue therapeutische Ans{\"a}tze zu identifizieren. Dabei konzentrierte ich mich unter Anwendung von molekularbiologischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden auf Faktoren, die an Entwicklung und Proliferation von E. multilocularis beteiligt sind. Darunter waren die drei MAP kinases des Parasiten EmMPK1, ein Erk1/2-Ortholog, EmMPK2, ein p38-Ortholog und EmMPK3, ein Erk7/8-Ortholog. Des Weiteren identifizierte und charakterisierte ich EmMKK2, ein MEK1/2-Ortholog des Parasiten, welches zusammen mit den bekannten Kinasen EmRaf und EmMPK1 ein Erk1/2-{\"a}hnliches MAPK Modul bildet. Ich konnte zudem verschiedene Einfl{\"u}sse von Wirtswachstumsfaktoren wie EGF (epidermal growth factor) und Insulin auf die Signalmechanismen des Parasiten und das Larvenwachstum zeigen, darunter die Phosphorylierung von Elp, ein Ezrin-Radixin-Moesin {\"a}hnliches Protein, die Aktivierung von EmMPK1 und EmMPK3 und eine gesteigerte mitotische Aktivit{\"a}t der Echinokokkenzellen. Zus{\"a}tzlich wurden verschiedene Substanzen auf ihre letale Wirkung auf den Parasiten untersucht, darunter befanden sich (1.) generelle Inhibitoren von Tyrosinkinasen (PP2, Leflunamid), (2.) gegen die Aktivit{\"a}t von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen gerichtete Pr{\"a}parate, (3.) urspr{\"u}nglich anti-neoplastische Wirkstoffe wie Miltefosin und Perifosin, (4.) Inhibitoren von Serin/ Threonin-Kinasen, die die Erk1/2 MAPK Kaskade blockieren und (5.) Inhibitoren der p38 MAPK. In diesen Untersuchungen hat sich EmMPK2 aus den folgenden Gr{\"u}nden als vielversprechendes Target erwiesen. Aminos{\"a}uresequenz-Analysen offenbarten einige Unterschiede zu menschlichen p38 MAP Kinasen, welche sehr wahrscheinlich die beobachtete gesteigerte basale Aktivit{\"a}t des rekombinanten EmMPK2 verursachen, verglichen mit der Aktivit{\"a}t humaner p38 MAPK-\&\#945;. Zus{\"a}tzlich suggerieren die prominente Autophosphorylierungsaktivit{\"a}t von rekombinantem EmMPK2 und das Ausbleiben einer Interaktion mit den Echinococcus MKKs einen unterschiedlichen Regulierungsmechanismus im Vergleich zu den humanen Proteinen. Die Aktivit{\"a}t von EmMPK2 konnte sowohl in vitro als auch in kultivierten Metazestodenvesikeln durch die Behandlung mit SB202190 und ML3403, zwei ATP kompetitiven Pyridinylimidazolinhibitoren der p38 MAPK, in Konzentrations-abh{\"a}ngiger Weise inhibiert werden. Zudem verursachten beide Substanzen, insbesondere ML3403 die Inaktivierung von Parasitenvesikeln bei Konzentrationen, die kultivierte S{\"a}ugerzellen nicht beeintr{\"a}chtigten. Ebenso verhinderte die Anwesenheit von ML3403 die Generation von neuen Vesikeln w{\"a}hrend der Kultivierung von Echinococcus Prim{\"a}rzellen. Das Targeting von Mitgliedern des EGF-Signalwegs, insbesondere der Erk1/2-{\"a}hnlichen MAPK Kaskade mit Raf- und MEK- Inhibitoren verhinderte die Phosphorylierung von EmMPK1 in in vitro kultivierten Metazestoden. Obwohl das Parasitenwachstum unter diesen Konditionen verhindert wurde, blieb die strukturelle Integrit{\"a}t der Metazestodenvesikeln w{\"a}hrend der Langzeitkultivierung in Anwesenheit der MAPK Kaskade-Inhibitoren erhalten. {\"A}hnliche Effekte wurden beobachtet nach Behandlung mit den anderen zuvor aufgef{\"u}hrten Inhibitoren. Zusammenfassend l{\"a}sst sich festhalten, dass verschiedene Targets identifiziert werden konnten, die hoch sensibel auf die Anwesenheit der inhibitorischen Substanzen reagierten, aber nicht zum Absterben des Parasiten f{\"u}hrten, mit Ausnahme der Pyridinylimidazolen. Die vorliegenden Daten zeigen, dass EmMPK2 ein {\"U}berlebendsignal vermittelnden Faktor darstellt und dessen Inhibierung zur Behandlung der AE benutzt werden k{\"o}nnte. Dabei erwiesen sich p38 MAPK Inhibitoren der Pyridinylimidazolklasse als potentielle neue Substanzklasse gegen Echinokokken.},
  subject      = {Fuchsbandwurm},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Fueller2008,
  author    = {F{\"u}ller, Jochen},
  title     = {Analysis of the binding properties of the kinase C-RAF to mitochondria and characterization of its effects on the cellular and molecular level},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35096},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {The proteins of the RAF family (A-RAF, B-RAF, and C-RAF) are serine/threonine-kinases that play important roles in development, mature cell regulation and cancer. Although it is widely held that their localization on membranes is an important aspect of their function, there are few data addressing this aspect of their mode of action. Here, we report that each member of the RAF family exhibits a specific distribution at the level of cellular membranes, and that C-RAF is the only isoform that directly targets mitochondria. We find that the RAF kinases exhibit intrinsic differences in terms of mitochondrial affinity, and that C-RAF is the only isoform that binds this organelle efficiently. This affinity is conferred by the C-RAF amino-terminal domain, and does not depend on the presence of RAS GTPases on the surface of mitochondria. Furthermore, we analyze the consequences of C-RAF activation on the cellular and molecular level. C-RAF activation on mitochondria dramatically changes their morphology and their subcellular distribution. On the molecular level, we examine the role of C-RAF in the regulation of the pro-apoptotic Bcl-2 family member BAD. This protein exhibits the original mode of regulation by phosphorylation. Although several reports addressed the regulation of BAD by C-RAF, the exact mode of action as well as the consequences of C-RAF activation on BAD are still not completely understood. We show that the inducible activation of C-RAF promotes the rapid phosphorylation of BAD on Serine-112 (Ser-75 in the human protein), through a cascade involving the kinases MEK and RSK. Our findings reveal a new aspect of the regulation of BAD protein and its control by the RAF pathway: we find that C-RAF activation promotes BAD poly-ubiquitylation in a phosphorylation-dependent fashion, and increases the turn-over of this protein through proteasomal degradation.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Pleines2009,
  author    = {Pleines, Irina},
  title     = {The role of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48572},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Platelet activation induces cytoskeletal rearrangements involving a change from discoid to spheric shape, secretion, and eventually adhesion and spreading on immobilized ligands. Small GTPases of the Rho family, such as Rac1 and Cdc42, are known to be involved in these processes by facilitating the formation of lamellipodia and filopodia, respectively. This thesis focuses on the role Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation from their precursor cells, the megakaryocytes (MKs), using conditional knock-out mice. In the first part of the work, the involvement of Rac1 in the activation of the enzyme phospholipase (PL) C2 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. It was found that Rac1 is essential for PLC2 activation independently of tyrosine phosphorylation of the enzyme, resulting in a specific platelet activation defect downstream of GPVI, whereas signaling of other activating receptors remains unaffected. Since Rac1-deficient mice were protected from arterial thrombosis in two different in vivo models, the GTPase might serve as a potential target for the development of new drugs for the treatment and prophylaxis of cardio- and cerebrovascular diseases. The second part of the thesis deals with the first characterization of MK- and platelet-specific Cdc42 knock-out mice. Cdc42-deficient mice displayed mild thrombo-cytopenia and platelet production from mutant MKs was markedly reduced. Unexpectedly, Cdc42-deficient platelets showed increased granule content and release upon activation, leading to accelerated thrombus formation in vitro and in vivo. Furthermore, Cdc42 was not generally required for filopodia formation upon platelet activation. Thus, these results indicate that Cdc42, unlike Rac1, is involved in multiple signaling pathways essential for proper platelet formation and function. Finally, the outcome of combined deletion of Rac1 and Cdc42 was studied. In contrast to single deficiency of either GTPase, platelet production from double-deficient MKs was virtually abrogated, resulting in dramatic macrothrombocytopenia in the animals. Formed platelets were largely non-functional leading to a severe hemostatic defect and defective thrombus formation in double-deficient mice in vivo. These results demonstrate for the first time a functional redundancy of Rac1 and Cdc42 in the hematopoietic system.},
  subject      = {Thrombose},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Muhammad2009,
  author    = {Muhammad, Khalid},
  title     = {Longterm impact of anti-CD20 mediated transient B cell depletion on memory B cells in patients with rheumatoid arthritis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36319},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {B-Lymphozyten leisten unterschiedliche Beitr{\"a}ge zur Pathophysiologie der Rheumatoiden Arthritis. Sie produzieren Autoantik{\"o}rper, pr{\"a}sentieren Autoantigene und sch{\"u}tten verschiedene Zytokine, die am proinflammatorischen Prozess beteiligt sind, aus. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in den letzten Jahren Therapien entwickelt, die gezielt B-Lymphozyten ansteuern um direkt oder indirekt in den autoimmunen Krankheitsverlauf einzugreifen. Die zeitlich begrenzte B-Zell-Depletion mit Rituximab (anti CD20-Antik{\"o}rper) hat dabei in den letzten Jahren einen hohen Stellenwert erlangt und wird im klinischen Alltag insbesondere bei der Behandlung von Patienten mit rheumatoider Arthritis angewandt. Rituximab induziert im peripheren Blut bemerkenswerte Ver{\"a}nderungen in der Hom{\"o}ostase der B-Zell-Subpopulationen. Nach Therapie mit dem anti-CD20 Antik{\"o}rper Rituximab beginnt die Repletionsphase mit der peripheren Aussaat von transitionalen unreifen B-Zellen. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Normalisierung des naiven B-Zell-Pools. Das B-Zell Ged{\"a}chtnis und in besonderem Maße die IgD+CD27+ Ged{\"a}chtniszellen erholen sich nach Therapie nur langsam. In einer prospektiven klinischen Studie hat unsere Arbeitsgruppe gezeigt, dass die Gesamtzahl der Ged{\"a}chtniszellen gut mit der Dauer der klinischen Antwort auf Rituximab korreliert. Es ist wenig {\"u}ber die speziellen molekularen Ver{\"a}nderungen innerhalb der Ged{\"a}chtnis B-Zellen nach Rituximab Therapie bekannt. Um die Ver{\"a}nderungen im peripheren Blut zu verstehen untersuchten wir die somatische Mutationsfrequenz und das Muster der Ig-VH3 Gen Rearrangements, indem wir pr{\"a}- und posttherapeutisch bei 18 Patienten einzelne B-Zellen isolierten und den individuellen B-Zellrezeptor durch eine Einzelzell RT-PCR amplifizierten und sequenzierten. Wir verglichen das Mutationsmuster nach erfolgreicher B-Zelldepletion in den neu rezirkulierenden Ged{\"a}chtnis B-Zellen mit dem Mutationsmuster von vier Gesunden Blutspendern und sechs nicht-RA Patienten, die eine Hochdosis Chemotherapie mit anschließender autologer oder allogener Stammzelltransplantation erhalten hatten. Zun{\"a}chst haben wir die Zusammensetzung der Ged{\"a}chtniszellen im peripheren Blut analysiert. Der Ph{\"a}notyp der peripheren pr{\"a}-switch (IgD+CD27+) und post-switch (IgD-CD27+) Ged{\"a}chtniszellen zeigte keine quantitativen Unterschiede in RA-Patienten im Vergleich zu Gesunden. Bei der direkten Analyse des B-Zell Immunglobulin Rezeptors fanden sich jedoch zwischen klassengeswitchten und ungeswitchten Ged{\"a}chtnis B-Zellen signifikante Unterschiede in der Anzahl der Mutationen in der variablen Region der Ig Rezeptors. Die Population der IgD+CD27+ Ged{\"a}chtniszellen beinhaltete sowohl nicht mutierte, wenig mutierte und stark mutierte (Median= 9 Mutationen pro Sequenz) rearrangierte Ig- Rezeptoren, wohingegen die IgD-CD27+ Ged{\"a}chtniszellen einen durchgehend hoch mutierten (Median = 18 Mutationen pro Sequenz) Rezeptor aufwiesen. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war signifikant (Mutationsfrequenzen 3.83±0.19\% vs. 7.1±0.53\%; P=0.0001). Grundlegende Ver{\"a}nderungen wurden bei den rezirkulierenden ungeswitchten Ged{\"a}chtniszellen (IgD+CD27+) nach vor{\"u}bergehender B-Zell Depletion mit Rituximab festgestellt. Diese Zellen wurden bis 6 Jahre nach Rituximab beobachtet und zeigten eine stark verz{\"o}gerte Zunahme an Mutationen im Ig-Rezeptor. Ein Jahr nach einmaliger Gabe von Rituximab waren 84\% der einzelnen zirkulierenden IgD+/CD27+ B-Zellen unmutiert. Zu diesem Zeitpunkt fanden sich keine stark mutierten Ig-VH3 Gen Rearrangements (P=0.0001). Mit zunehmendem Abstand zur B-Zell depletierenden Therapie konnten in der Repopulationsphase zunehmende Zahlen an Mutationen in den B-Zell Ig Rezeptoren festgestellt werden. Beispielsweise waren w{\"a}hrend des 2. Jahres der Regeneration (P=0.0001) 7.8\%, sowie nach 4 Jahren nur 14\% der Ig Rezeptoren mutiert. Sogar 6 Jahre nach Behandlung, waren VH Mutationen in IgD+ Ged{\"a}chtniszellen noch deutlich vermindert. Selbst nach dieser Zeit fanden sich in der pr{\"a}-switch Ged{\"a}chtnispopulation nur 27\% hochmutierte Sequenzen w{\"a}hrend vor der passageren B-Zelldepletion 52\% ein hohe Zahl an Mutationen trugen (P=0.0001). Die posttherapeutische Analyse der CDR3 L{\"a}nge der regenerierten IgD+ Ged{\"a}chtniszellen ergab eine erh{\"o}hte CDR3 L{\"a}nge, die signifikant mit der Anzahl der nicht mutierten VH Genrearrangements w{\"a}hrend der Repletionsphase korreliert. Interessanterweise regenerierten Patienten nach Hochdosis Chemotherapie und allogener Stammzelltransplantation ihre IgD+ Ged{\"a}chtniszellen mit einer deutlich h{\"o}heren Anzahl an Mutationen. Ein Jahr nach Transplantation zeigten die Ig Rezeptoren schon 22\% hoch mutierte und 42\% unmutierte VH Rearrangements. Das zeigt, dass eine gegen CD20 gerichtete Behandlung nicht nur eine Verz{\"o}gerung der Produktion der ungeswitchten Ged{\"a}chtniszellen zur Folge hat, sondern dar{\"u}ber hinaus einen signifikanten Effekt auf die Mutationsrate im pr{\"a}switch Ged{\"a}chtnis B-Zellpool besitzt. Im Gegensatz zum Mutationsmuster der IgD+ Ged{\"a}chtniszellen regenerierten die klassengeswitchten Ged{\"a}chtniszellen nach anti-CD20 Depletion im peripheren Blut mit quantitativ normalen Mutationen im Ig Rezeptor. Interessanterweise fand sich allerdings eine {\"A}nderung der exprimierten Isotypen mit deutlicher Dominanz IgA exprimierender B Zellen. Weitere Analysen der klassengeswitchten Ged{\"a}chtnis B-Zellen zeigen außerdem eine Therapie induzierte qualitative Ver{\"a}nderung dieses B-Zellpools. So waren posttherapeutisch die Mutationen in bestimmten T-Zell abh{\"a}ngigen Mutationshotspots, dem RGYW/WRCY Motiv, signifikant vermehrt (Mutationstargeting vor Therapie 27\% vs. 43\% nach Rituximab, P=0.0003). Dies weist darauf hin, dass die Mechanismen der Affinit{\"a}tsreifung im klassengeswitchten B-Zellged{\"a}chtnis vor und nach B-Zelldepletion unterschiedlich funktionieren. Der Mutationsmechanismus selbst ist allerdings in diesen Zellen quantitativ nicht eingeschr{\"a}nkt. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit zum erstem mal, dass es nach einer passageren B-Zelldepletion mit anti-CD20 Antik{\"o}rpern zu einer {\"u}ber Jahre hinweg nachweisbaren ausgepr{\"a}gten Verz{\"o}gerung in der Aquisition von somatischen Mutationen in rearrangierten VH Genen der IgD+ Ged{\"a}chtniszellen kommt. Demgegen{\"u}ber erholt sich das klassengeswitchte B-Zellged{\"a}chtnis mit uneingeschr{\"a}nkter Zahl von Mutationen im Ig Rezeptor. Diese Resultate zeigen, dass anti-CD20 gerichtete Therapien in besonderem Maße IgD+ Ged{\"a}chtniszellen beeinflussen. Der Selektionsdruck durch Antigene und/oder die Selektion der Ig Rezeptoren erscheint unter diesen Bedingungen speziell bei IgD-Ged{\"a}chtnis B-Zellen reduziert. Die Daten unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass pr{\"a}-switch Ged{\"a}chtnis B-Zellen im Vergleich zu post-switch Ged{\"a}chtnis B-Zellen andere Bedingungen f{\"u}r die Aktivierung der Mutationsmaschinerie ben{\"o}tigen. Die Resultate er{\"o}ffnen neue Wege f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Pathophysiologie der B-Zell Ged{\"a}chtnisentwicklung und k{\"o}nnen helfen neue zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu konzipieren.},
  subject      = {Rheumatoider arthritis},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Erro2009,
  author    = {Erro, Alejandro Berna},
  title     = {Generation and Characterization of Stromal Interaction Molecule 2 (STIM2)-deficient Mice},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47301},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {An increase in cytosolic Ca2+ levels ([Ca2+]i) is a key event that occurs downstream of many signaling cascades in response to an external stimulus and regulates a wide range of cellular processes, including platelet activation. Eukaryotic cells increase their basal [Ca2+]i allowing extracellular Ca2+ influx into the cell, which involves different mechanisms. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) is considered the main mechanism of extracellular Ca2+ influx in electrically non-excitable cells and platelets, and comprises an initial Ca2+ depletion from intracellular Ca2+ stores prior to activation of extracellular Ca2+ influx. Although the close relation between Ca2+ release from intracellular stores and extracellular Ca2+ influx was clear, the nature of the signal that linked both events remained elusive until 2005, when Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) was identified as an endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ sensor essential for inositol (1,4,5)-trisphosphate (IP3)-mediated SOCE in vitro. However, the function of its homologue STIM2 in Ca2+ homeostasis was in general unknown. Therefore, mice lacking STIM2 (Stim2-/-) were generated in this work to study initially STIM2 function in platelets and in cells of the immune system. Stim2-/- mice developed normally in size and weight to adulthood and were fertile. However, for unknown reasons, they started to die spontaneously at the age of 8 weeks. Unexpectedly, Stim2-/- mice did not show relevant differences in platelets, revealing that STIM2 function is not essential in these cells. However, STIM2 seems to be involved in mammary gland development during pregnancy and is essential for mammary gland function during lactation. CD4+ T cells lacking STIM2 showed decreased SOCE. Our data suggest that STIM2 has a very specific function in the immune system and is involved in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) at early stages of the disease progression. Stim2-/- neurons were also defective in SOCE. Surprisingly, our results evidenced that STIM2 participates in mechanisms of neuronal damage after ischemic events in brain. This is the first time that the involvement of SOCE in ischemic neuronal damage has been reported. This finding may serve as a basis for the development of novel neuroprotective agents for the treatment of ischemic stroke, and possibly other neurodegenerative disorders in which disturbances in cellular Ca2+ homeostasis are considered a major pathophysiological component.},
  subject      = {Calcium-bindende Proteine},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Nekhoroshkova2009,
  author    = {Nekhoroshkova, Elena},
  title     = {A-RAF kinase functions in ARF6 regulated endocytic membrane traffic},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-44566},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system.},
  subject      = {Raf-Kinasen},
  language  = {en}
}