@phdthesis{Peinz2016,
  author    = {Peinz, Ulrich},
  title     = {Strukturbasiertes computergest{\"u}tztes Wirkstoffdesign an flexiblen Proteintargets: Aldose Reduktase und Hsp70},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-147103},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Proteine sind dynamische makromolekulare Systeme, die nativ in verschiedenen Konfor-mationen vorliegen. Besonders Proteine mit einer ausgepr{\"a}gten intrinsischen Flexibilit{\"a}t stellen als biologische Zielstrukturen f{\"u}r das computergest{\"u}tzte strukturbasierte Wirkstoff-design auch heute noch eine große Herausforderung dar. Die vorliegende Arbeit thematisiert die computergest{\"u}tzte Identifizierung neuer Liganden mit inhibitorischer Aktivit{\"a}t f{\"u}r zwei strukturell sehr flexible Enzyme, die bei verschiedenen Krankheiten eine pathophysio-logische Rolle spielen. Ein Schwerpunkt lag in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung virtueller Screeningverfahren, die es erm{\"o}glichten, die Flexibilit{\"a}t der Proteine ad{\"a}quat zu ber{\"u}cksichtigen. Der erste Teil der Arbeit beschreibt ein virtuelles Screeningverfahren f{\"u}r die Identifizierung von Liganden einer neuen, durch Molekulardynamik (MD) Simulationen generierten Proteinkonformation der Aldose Reduktase (AR), einem Enzym, das im Zusammenhang mit der Entstehung von Folgeerkrankungen bei Diabetes mellitus steht. Die angewandte Vorgehensweise zeigt M{\"o}glichkeiten auf, wie eine ausgepr{\"a}gte Proteinflexibilit{\"a}t mit Hilfe computerbasierter Methoden im Rahmen eines virtuellen Screenings explizit ber{\"u}cksichtigt werden kann. Die Studie war auf der einen Seite hinsichtlich methodischer Aspekte von Interesse, da dadurch sowohl eine Beurteilung der Aussagekraft computergenerierter Proteinkonformationen, als auch eine {\"U}berpr{\"u}fung der prinzipiellen Eignung MD-generierter Enzymkonformationen als Template f{\"u}r strukturbasierten Ligandendesignstudien, erfolgen konnte. Auf der anderen Seite war diese Studie aufgrund einer m{\"o}glichen Erweiterung des bekannten Konformationsraumes der AR auch aus strukturbiologischer Sicht von Interesse. Bei der Suche nach geeigneten Liganden in Molek{\"u}ldatenbanken kommerziell erh{\"a}ltlicher Verbindungen wurde eine protein- und eine ligandbasierte Strategie verfolgt. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zun{\"a}chst eine vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexstrukturen, um Informationen hinsichtlich experimentell aufgekl{\"a}rter Bindemotive, Protein-Ligand-Interaktionen sowie bestehender struktureller Differenzen zwischen der MD-Konformation und anderen Bindetaschenkonformationen der AR zu sammeln. Anschließend wurde die Bindetasche der MD-generierten Proteinstruktur hinsichtlich g{\"u}nstiger Interaktionspunkte analysiert, um aus den Erkenntnissen Pharmako-phormodelle als Filter f{\"u}r die nachfolgenden virtuellen Datenbanksuchen zu entwickeln. Als Erg{\"a}nzung zum proteinbasierten Ansatz wurde eine ligandbasierte Strategie f{\"u}r die Identifizierung potenzieller Kandidatenmolek{\"u}le verfolgt. Dabei diente ein bekannter AR-Inhibitor als Templatstruktur, bei dem aufgrund zuvor durchgef{\"u}hrter Dockingexperimente die begr{\"u}ndete Annahme bestand, dass dieser die Bindetaschenform der MD-Proteinkonfor-mation stabilisieren k{\"o}nnte. Hierbei wurde zun{\"a}chst eine Molek{\"u}ldatenbank aus kommerziell erh{\"a}ltlichen Verbindungen, die alle {\"u}ber eine bestimmte Substruktur als Ankergruppe verf{\"u}gten, aufgebaut und anschließend durch Berechnung molekularer {\"A}hnlichkeiten zu der Templatstruktur auf m{\"o}gliche Kandidatenmolek{\"u}le durchsucht. Die virtuell identifizierten Molek{\"u}le der beiden Ans{\"a}tze wurden im Anschluss mit Hilfe von Dockingsimulationen in die Bindetasche der MD-generierten Proteinkonformation gedockt und die berechneten Bindeposen mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren bewertet. Im n{\"a}chsten Schritt erfolgte eine Untersuchung der Selektivit{\"a}t der Kandidatenmolek{\"u}le anhand eines Cross-Dockingexperiments an verschiedenen Bindetaschenkonformationen der AR. Auf der Grundlage aller durch das virtuelle Screeningverfahren gesammelten Informationen wurde eine finale Molek{\"u}lauswahl getroffen und sechs kommerziell verf{\"u}gbare Molek{\"u}le f{\"u}r experimentelle Untersuchungen bezogen. Die experimentelle Bestimmung der Enzyminhibition wurde dabei von Kooperationspartnern mit Hilfe eines in vitro Assays untersucht. Aufgrund einer unzureichenden L{\"o}slichkeit von vier Substanzen unter den Assaybedingungen konnte lediglich das Inhibitionspotenzial von zwei Verbindungen untersucht werden. Eine der Verbindungen zeigte bemerkenswerterweise eine inhibitorische Aktivit{\"a}t im einstelligen mikromolaren Bereich. Eine finale Beurteilung, ob die Zielsetzung dieser Studie, eine neue computergenerierte Bindetaschenkonformation der AR experi-mentell zug{\"a}nglich zu machen, durch die vorgeschlagenen Verbindungen erf{\"u}llt werden konnte, konnte zum Zeitpunkt der Anfertigung der Dissertation aufgrund ausstehender Kristallstrukturen der jeweiligen AR-Ligand-Komplexe nicht erfolgen und bleibt das Ziel zuk{\"u}nftiger Arbeiten. Die Studie zeigte jedoch deutlich, dass nicht nur experimentell aufgekl{\"a}rte Proteinstrukturen sondern auch die Nutzung von mit Hilfe computerbasierter Verfahren, wie z.B. mittels MD Simulationen, berechneter Proteinkonformationen als Templatstrukturen f{\"u}r die Identifi-zierung neuer Liganden hilfreich sein kann und daher deren Verwendung f{\"u}r diese Zielsetzung ihre Berechtigung hat. Der zweite Teil der Arbeit handelt von der computergest{\"u}tzten Identifizierung nieder-molekularer Liganden einer neuen potenziellen Bindestelle der biologischen Zielstruktur Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren. Hsp70 spielt eine pathophysiologische Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen sowie diversen weiteren Erkrankungen, wie z.B. neurodegenerativen Erkrankungen und Infektions-krankheiten. Bei der neuen potenziellen Bindestelle, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit n{\"a}her untersucht wurde, handelte es sich um das Interdom{\"a}neninterface, der Schnittstelle zwischen der Nukleotid- und Substratbindedom{\"a}ne von Hsp70. Zum Zeitpunkt der Arbeit waren keine Liganden dieser Proteinregion in der Literatur beschrieben, weshalb es zun{\"a}chst galt, die Hypothese der Adressierbarkeit dieser Zielregion durch niedermolekulare Liganden zu verifizieren. Hierf{\"u}r wurde ein virtuelles Screening durchgef{\"u}hrt, bei dem protein- sowie ligandbasierte Suchstrategien zum Einsatz kamen. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zun{\"a}chst eine Analyse der Hsp70 Terti{\"a}r-struktur auf potenziell vorhandene Ligandenbindestellen. Im Anschluss wurde das Interdom{\"a}neninterface auf g{\"u}nstige Interaktionspunkte f{\"u}r bestimmte Atomtypen und funktionelle Gruppen zuk{\"u}nftiger Liganden untersucht. Basierend auf diesen Informationen wurde ein Pharmakophormodell als Filter f{\"u}r nachfolgende virtuelle Datenbanksuchen entwickelt. Bei dem ligandbasierten Ansatz fungierte der bekannte Hsp70-Ligand Apoptozol als Templatstruktur f{\"u}r die virtuelle Datenbanksuche, da die Ergebnisse eines vorab durchge-f{\"u}hrten Cross-Dockingexperiments deutlich auf eine Bindung des Molek{\"u}ls an das Interdom{\"a}neninterface hinwiesen. Diese Dockingstudie lieferte erste wertvolle Hinweise hinsichtlich der Bindestelle und potenzieller Bindemodi des Molek{\"u}ls an Hsp70. Im Anschluss an die virtuellen Datenbanksuchen wurden die identifizierten Kandidaten-molek{\"u}le hinsichtlich m{\"o}glicher Bindemodi und Bindungsaffinit{\"a}ten mittels Docking-simulationen in Verbindung mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren untersucht. Abschließend wurden neun ausgew{\"a}hlte Kandidatenmolek{\"u}le von kommerziellen Anbietern bezogen und mit Hilfe von in vitro Assays von Kooperationspartnern innerhalb der Klinischen Forschergruppe 216 auf ihre zytotoxische Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Multiplen Myelomzellen untersucht. Dabei konnte f{\"u}r f{\"u}nf der neun getesteten Verbindungen bereits bei Konzentrationen im ein- bzw. zweistelligen mikromolaren Bereich eine Aktivit{\"a}t gemessen werden, was einer formalen Trefferquote von 56\% entspricht. Weiterhin wurde und wird in Folgearbeiten von Kooperationspartnern versucht, eine Bindung der ausgew{\"a}hlten Kandidatenmolek{\"u}le an Hsp70 n{\"a}her zu charakterisieren und sowohl am separierten Protein, als auch in der Targetzelle nachzuweisen. Dar{\"u}ber hinaus wurde zus{\"a}tzlich ein fragmentbasierter Ansatz, basierend auf einer bestimmten Substruktur, die als eine Art Ankergruppe fungieren sollte, verfolgt. Dabei diente bei der virtuellen Suche in Molek{\"u}ldatenbanken kommerzieller Anbieter ein Molek{\"u}lfragment als Suchanfrage. Aus dem identifizierten Molek{\"u}lsatz wurden Verbindungen unterschied-lichster struktureller Klassen f{\"u}r nachfolgende Dockingexperimente ausgew{\"a}hlt. Die berechneten Bindeposen wurden einem Re-Scoringverfahren f{\"u}r eine zus{\"a}tzliche Absch{\"a}tzung der Bindungsaffinit{\"a}t unterzogen. Schließlich wurden die f{\"u}nf vielver-sprechendsten Verbindungen f{\"u}r nachfolgende experimentelle Untersuchungen kommerziell bezogen. Die Ergebnisse der nachfolgenden r{\"o}ntgenkristallographischen Aufkl{\"a}rung der Protein-Ligand-Komplexe lagen bei der Anfertigung der vorliegenden Dissertation noch nicht abschließend vor und sind Bestandteil aktueller Forschungarbeiten. Mit den durchgef{\"u}hrten virtuellen Screeningverfahren konnten erstmals potenzielle Liganden des Hsp70-Interdom{\"a}neninterfaces als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren identifiziert werden. Weiterhin k{\"o}nnen die identifizierten, zytotoxisch aktiven Verbindungen als Leitstrukturen zuk{\"u}nftiger Inhibitordesignstudien dienen, mit dem Ziel sowohl die Zytotoxizit{\"a}t dieser Molek{\"u}le zu optimieren, als auch Struktur-Wirkungsbeziehungen f{\"u}r die Entwicklung von Inhibitoren mit verbesserten biologischen Aktivit{\"a}tsprofilen abzuleiten. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der computerbasierten Charakterisierung der Proteinflexibilit{\"a}t von Hsp70 mit Hilfe von MD Simulationen. In diesem Zusammenhang erfolgte eine Untersuchung intrinsischer Proteinbewegungen sowie des Konformations-raumes anhand von verschiedenen Hsp70-Enzymstrukturen. Die durchgef{\"u}hrten MD Simulationen waren zum Zeitpunkt der Arbeit die ersten Untersuchungen dieser Art, die nicht nur an einer einzelnen Dom{\"a}ne, sondern an ganzen Zweidom{\"a}nenstrukturen von Hsp70 erfolgten. Die generierten Trajektorien best{\"a}tigten die {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t der Zielstruktur Hsp70. Die im Rahmen der Studie identifizierten, zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebenen Proteinkonformere erweiterten das Spektrum der bekannten Hsp70-Proteinkonformationen erheblich und lieferten m{\"o}gliche Enzymkonformationen, die als Templatstrukturen f{\"u}r zuk{\"u}nftige strukturbasierte Wirkstoffdesignstudien dienen k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus st{\"u}tzten die Beobachtungen die Hypothese der prinzipiellen Eignung des Interdom{\"a}neninterfaces von Hsp70 als eine Bindestelle f{\"u}r neue Inhibitoren. Auf der Grundlage der gewonnenen Informationen war es weiterhin m{\"o}glich, eine erste Hypothese hinsichtlich eines potenziellen inhibitorischen Wirkmechanismus der Liganden des Interdom{\"a}neninterfaces zu formulieren. Abschließend l{\"a}sst sich festhalten, dass durch die vorliegende Arbeit viele neue strukturbiologische Erkenntnisse {\"u}ber Hsp70 gewonnen wurden. Dennoch besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Strukturbiologie von Hsp70 umfassend aufzukl{\"a}ren. M{\"o}glicher-weise k{\"o}nnen in zuk{\"u}nftigen Studien Enzymstrukturen aufgekl{\"a}rt werden, die die Existenz der in silico erzeugten und in der Arbeit beschriebenen Proteinkonformere best{\"a}tigen.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zilian2014,
  author    = {Zilian, David},
  title     = {Neuartige, empirische Scoring-Modelle f{\"u}r Protein-Ligand-Komplexe und computergest{\"u}tzte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Techniken des computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schl{\"u}sselrolle im strukturbasierten computergest{\"u}tzen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zun{\"a}chst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergr{\"o}ßern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex besch{\"a}ftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivit{\"a}t klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich {\"u}berlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im n{\"a}chsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinit{\"a}ten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivit{\"a}t der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verf{\"u}gbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repr{\"a}sentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings erm{\"o}glicht. F{\"u}r die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der gr{\"o}ßten, die bisher f{\"u}r die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datens{\"a}tze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den urspr{\"u}nglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten f{\"u}r beide Datens{\"a}tze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datens{\"a}tzen zeigt - ein Ph{\"a}nomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datens{\"a}tze ergab dar{\"u}ber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie {\"u}ber die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor f{\"u}r die protein-abh{\"a}ngigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verl{\"a}ssliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums m{\"o}glich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ans{\"a}tze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' f{\"u}r die SFCscore-Funktionen definieren l{\"a}sst. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zus{\"a}tzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverl{\"a}sslichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgesch{\"a}tzt werden k{\"o}nnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt f{\"u}r weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren f{\"u}r das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur f{\"u}r die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Dom{\"a}nen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zun{\"a}chst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erkl{\"a}rt werden. F{\"u}r die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Dom{\"a}nen-System, dass verschiedene allostere Zust{\"a}nde einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilit{\"a}t auf die Stabilit{\"a}t der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen f{\"u}r das Protein durchgef{\"u}hrt. Diese zeigen, dass das Protein tats{\"a}chlich eine {\"u}berdurchschnittlich hohe Flexibilit{\"a}t aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Dom{\"a}nen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgef{\"u}hrten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise daf{\"u}r gefunden werden, dass die Mutationen, welche die f{\"u}r die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilit{\"a}t des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Dom{\"a}nenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilit{\"a}t auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zuk{\"u}nftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verkn{\"u}pft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt f{\"u}r die Inhibtion des Proteins darstellt.},
  subject      = {Arzneimittelforschung},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hein2014,
  author    = {Hein, Michael},
  title     = {Entwicklung computergest{\"u}tzter Methoden zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen und Entwurf niedermolekularer MIP-Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-101585},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Dockingbasierte Ans{\"a}tze z{\"a}hlen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Absch{\"a}tzung der Bindungsaffinit{\"a}t zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollst{\"a}ndig gel{\"o}stes Problem f{\"u}r Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergest{\"u}tzter Methoden zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Ber{\"u}cksichtigung der Abs{\"a}ttigung vergrabener Wasserstoffbr{\"u}ckenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-L{\"o}sungen. Nicht-abges{\"a}ttigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinit{\"a}t abtr{\"a}glichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinit{\"a}tsdaten in Scoringfunktionen vernachl{\"a}ssigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur H{\"a}ufigkeit vergrabener nicht-abges{\"a}ttigter HBA und HBD in hochaufgel{\"o}sten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB"-Filterfunktion) entwickelt, die unerw{\"u}nschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde f{\"u}r die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-L{\"o}sungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die H{\"a}ufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Abs{\"a}ttigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen f{\"u}r eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abges{\"a}ttigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollst{\"a}ndige Abs{\"a}ttigung durch entsprechende Proteinpartner wird f{\"u}r ca. 48 \% der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 \% weisen weniger als drei haupts{\"a}chlich schwache, nicht-abges{\"a}ttigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolek{\"u}len in die H{\"a}ufigkeitsanalyse sind sogar f{\"u}r ca. 61 \% aller Komplexe alle wasserstoffbr{\"u}ckenbindenden Gruppen abges{\"a}ttigt. Im Gegensatz zu DSX werden f{\"u}r SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erh{\"o}hte Erfolgsraten f{\"u}r das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 {\AA} Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. F{\"u}r die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power" bezeichneten Kriteriums f{\"u}r die Top-3-Posen (Erfolgsrate f{\"u}r die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 {\AA} Pose unter den besten drei Docking-L{\"o}sungen) von 63.1 \% auf 64.2 \% beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer {\"U}berlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-L{\"o}sungen ber{\"u}cksichtigt. Die ad{\"a}quate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist f{\"u}r die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinit{\"a}ts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zun{\"a}chst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash"-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der H{\"a}ufigkeit ung{\"u}nstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgel{\"o}sten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der H{\"a}ufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash"-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-L{\"o}sungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerw{\"u}nschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die H{\"a}ufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 \% der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ung{\"u}nstigen Beitr{\"a}ge pro Komplex f{\"u}r 50 \% aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch k{\"o}nnen diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein bzw. durch g{\"u}nstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash"-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power f{\"u}r SFCscore. F{\"u}r die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten f{\"u}r das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-L{\"o}sungen von 61.4 \% auf 86.9 \% erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 \%; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 \%). Die „Clash"-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash"- und der „vnaHB"-Filterfunktion {\"u}berlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinit{\"a}tsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergest{\"u}tzter Methoden zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen gelegt. Dadurch soll eine ad{\"a}quate Ber{\"u}cksichtigung ung{\"u}nstiger Beitr{\"a}ge zur Bindungsaffinit{\"a}t erm{\"o}glicht werden, die f{\"u}r die Richtigkeit und Zuverl{\"a}ssigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden bin{\"a}re Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-L{\"o}sungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verf{\"u}gbarkeit von Affinit{\"a}tsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash"-Deskriptor, und die Decoy-Datens{\"a}tze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsf{\"a}higsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten" RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power f{\"u}r das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabh{\"a}ngigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegen{\"u}ber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatens{\"a}tzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 \%, RF 87.27 \%; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 \%, RF 91.38 \%). Das „beste" Modell zeichnet sich durch die zuverl{\"a}ssige Vorhersage richtig-positiver Docking-L{\"o}sungen f{\"u}r einige wenige Komplexe aus, f{\"u}r die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose f{\"u}r diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung f{\"u}r die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren f{\"u}r die Klassifizierung von Docking-L{\"o}sungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-ber{\"u}cksichtigter Beitr{\"a}ge zur Bindungsaffinit{\"a}t stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator"-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein f{\"u}r die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolins{\"a}ure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten f{\"u}r die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen g{\"u}nstige Wechselwirkungsbereiche f{\"u}r Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einf{\"u}hrung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erh{\"o}hten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zus{\"a}tzlichen Wasserstoffbr{\"u}cke zu Gly116 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Selektivit{\"a}tsverbesserungen gegen{\"u}ber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere f{\"u}r das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivit{\"a}tsindex (1): 45, Selektivit{\"a}tsindex (2n): 4.2; mit Selektivit{\"a}tsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) f{\"u}hrt zu einer verbesserten L{\"o}slichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein f{\"u}r die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten f{\"u}r die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgef{\"u}hrt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Gr{\"o}ßere konformelle {\"A}nderungen werden lediglich f{\"u}r den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien f{\"u}r 1 erforderlich macht. G{\"u}nstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits f{\"u}r Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits f{\"u}r Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl f{\"u}r Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erh{\"o}hte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring f{\"u}hrt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter L{\"o}slichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen f{\"u}r weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern.},
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